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培养间充质干细胞的上清液对食管癌ECA109生物学行为的影响

2024-05-09 21 上传者：管理员

摘要：目的:探讨脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)培养的上清液对食管癌细胞ECA109增殖、迁移、凋亡等生物学行为的影响。方法:培养人脐带MSCs,提取过滤脐带MSCs培养的上清液与食管癌细胞ECA109共培养，通过细胞划痕实验和CCK-8实验检测ECA109细胞迁移、增殖能力；采用流式细胞测定技术检测ECA109细胞凋亡情况；利用RT-PCR和Western blot检测相关通路中ERK、AKT、PI3K的表达水平。结果:划痕实验48 h, MSCs上清液共培养组ECA109细胞划痕面积为(17.157±1.425)μm2,明显高于对照组划痕面积(14.500±0.563)μm2(P=0.04);CCK-8结果显示，48 h后MSCs上清液培养组ECA109细胞OD值(1.069±0.254)显著低于对照组(1.718±0.520)(P=0.037);流式细胞术检测结果显示MSCs上清液共培养组细胞早期凋亡率(12.36±2.47)%高于对照组(7.23±0.86)%;G2+S期MSCs上清液共培养组细胞比例(39.82±1.01)%相比对照组(55.17±9.60)%显著减少。RT-PCR结果显示，MSCs上清液共培养组AKT mRNA表达量(0.35±0.01)明显低于对照组(1.00±0.05)(P=0.004);Western blot可以看出，MSCs上清液共培养组ERK、AKT蛋白表达均低于对照组，差异有统计学意义。结论：MSCs上清液抑制食管癌细胞ECA109的增殖和迁移能力，促进ECA109细胞的凋亡，且ERK和AKT的蛋白质表达水平均下降。

关键词：
MSCs
增殖迁移能力
自我更新
间充质干细胞上清液
食管癌
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食管癌是消化系统常见恶性肿瘤，根据世界卫生组织下属国际癌症研究机构GLOBOCAN 2020 的估计，2020年全球新发食管癌60.41万例，死亡54.41万例，分别居恶性肿瘤发病和死亡谱的第7位和第6位[1]。食管癌迁移力强，因缺乏早期特异性的临床症状，大部分食管癌患者就诊时肿瘤已发生转移或处于晚期，导致其死亡率居高不下。我国是食管癌高发地区，2020年中国新发食管癌32.44万例，死亡30.11万例，分别占全球发病人数和死亡人数的53.70%和55.34%[2]。近年来随着食管癌诊断技术的发展及放化疗方案的优化，少部分食管癌患者从中受益，但术后5年生存率仅仅只有15%～25%[1]。因此，探索有效抑制食管癌细胞增殖和迁移的治疗手段具有重要的临床意义。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)属于成体干细胞，具有较强的自我更新和多向分化的能力[3],存在于许多不同的组织和器官中，例如脂肪组织、骨髓、皮肤、脐血等[4],MSCs具有良好的免疫调节和免疫抑制作用[5],还参与组织的发育和修复[6]。目前已被应用于造血系统疾病、抗移植排斥、器官缺血性损伤的修复和自身免疫性疾病的免疫调节临床治疗中。近年来研究显示，当机体中有肿瘤发生时，MSCs能立即感知到“异常信号”的召唤，聚集至肿瘤微环境并发挥调节作用，但其对肿瘤细胞是抑制还是促进目前存在争议。MSCs在增殖分化过程中产生各种微囊泡及生物性因子，通过旁分泌和分化作用调节肿瘤发展进程，但MSCs培养的上清液对肿瘤细胞的生长作用研究较少，故本实验收集MSCs上清液，与食管癌细胞ECA109进行共培养，观察食管癌ECA109细胞增殖、迁移及凋亡的生物学行为变化，初步探讨MSCs培养液对食管癌细胞的作用，挖掘可能发挥作用的分子机制，为食管癌治疗的新手段提供实验证据和理论依据。

1、材料与方法

1.1 细胞与主要试剂、仪器

食管癌细胞系ECA109由新疆医科大学科研中心提供，脐带MSCs由新疆组织细胞工程重点实验室提供。DMEM培养基、RPMI 1640培养基、胎牛血清、双抗、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液(美国Gibco公司);兔抗人ERK抗体，兔抗人AKT抗体，兔抗人PI3K抗体(Cell Signal);羊抗兔IgG抗体(武汉博士德公司);氯仿、异丙醇、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司);PCR扩增引物(上海生物工程有限公司);凋亡试剂盒(德国Sigma公司);CCK-8 试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);酶标仪(美国Bio-Tek公司); RT-PCR试剂盒(北京索莱宝科技公司);引物序列(北京生工公司);实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司);流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 MSCs上清液的提取

将新疆组织与细胞重点实验室提供的MSCs培养于含10%胎牛血清以及100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM培养基中，放入37 ℃、5%CO2培养箱内培养。取3、4代MSCs, 当细胞密度达到80%,收集液体，2 000 r/min低温离心5 min, 取上清，0.22 μm 滤器过滤，去除死细胞及细胞碎片，-80 ℃保存备用。

1.2.2 食管癌细胞ECA109的培养

食管癌细胞ECA109培养于含10%胎牛血清以及100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，放入37 ℃、5%CO2培养箱内培养，细胞生长至对数生长期用于实验。

1.2.3 实验分组

MSCs培养上清液共培养组：将MSCs培养的上清液与RPMI 1640完全培养基体积比为1∶4作为条件培养液与食管癌ECA109细胞共培养；空白对照组：用未加任何处理的 RPMI 1640完全培养基培养食管癌ECA109细胞。每组设置3个复孔。

1.2.4 细胞划痕实验

取对数生长期的ECA109细胞，以每孔6×105个接种于6孔板中，细胞贴壁后，用200 μL移液枪头在6孔板底部划一直线，各实验组加入低血清培养基(2.5%的FBS)培养，测量0、24、48 h划痕面积，实验重复3次，使用ImageJ软件计算划痕面积，并用统计学软件进行分析。

1.2.5 CCK-8细胞增殖实验

按照CCK-8细胞增殖试剂盒说明书进行操作，各组细胞设5个复孔，37 ℃、5%CO2培养，0、24、48 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL,继续培养1.5 h, 采用分光光度计测量450 nm波长光密度(optical density, OD) 值，计算细胞增殖活性。

1.2.6 流式细胞术检测凋亡

各组细胞处理培养48 h后，胰蛋白酶消化并收集细胞，调节细胞密度制成细胞悬液，按照Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明进行操作，检测细胞凋亡率。

1.2.7 细胞总RNA提取、逆转录及RT-PCR检测

收集各组细胞，Trizol试剂一步法提取总RNA,紫外分光光度计测定其纯度。以提取的总RNA为模板，按逆转录试剂盒说明书进行逆转录。以得到的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增反应体积为20 μL,其中cDNA模板2 μL,待扩增基因上下引物各1 μL,即用PCR反应试剂盒反应溶液(2倍浓度)10 μL,双蒸水6 μL,扩增反应结束后，采用相对定量法分别计算目的基因相对于内参照(GAPDH)的表达量。

1.2.8 Western blot检测蛋白表达

收集各组细胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min, 低温离心，取上清分装， BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品上样到SDS-PAGE胶加样孔内，电压100 V时间90～120 min。然后转膜、封闭过夜、一抗孵育 (1∶1 000)90 min, PBS洗脱三次，二抗孵育(1∶400)60 min, 进行洗脱后X光曝光成像，ImageJ系统分析计算蛋白相对含量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0统计学软件进行分析。计量资料数据采用形式表示，组间两两比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 培养及鉴定人脐带MSCs

新疆组织与细胞重点实验室提供的人脐带MSCs培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在镜下可见传至第三代时MSCs贴壁生长，形态均匀一致呈长条梭形(图1)。流式抗体鉴定MSCs表面分子可见(图2),细胞高表达CD73(99.06%)、CD105(99.91%)、CD90(99.93%)表面抗原，而低表达的表面抗原有CD19(0.43%)、HLA-DR(1.35%)、CD45(0.52%)、CD34(1.60%)和CD11b(1.45%)。符合MSCs的生物学特性，可用于后续实验。

图1 光镜下人脐带MSCs的形态学观察(×400)

2.2 MSCs上清液抑制食管癌细胞ECA109的迁移

在0、24、48 h分别检测划痕面积，划痕愈合实验结果显示，0 h时MSCs上清液共培养组划痕面积为(20.731±1.778)μm2,对照组为(19.196±3.910)μm2,二者无明显差异。而48 h后MSCs上清液共培养组ECA109细胞划痕面积为(17.157±1.425)μm2,明显大于对照组划痕面积(14.500±0.563)μm2(图3),差异有统计学意义(P=0.04,P<0.05,见表1)。可见食管癌细胞ECA109的迁移能力被抑制。

2.3 MSCs上清液抑制食管癌细胞ECA109的增殖

CCK-8结果分析显示(表2和图4),0 h和12 h时两组细胞OD值无明显差异(P>0.05);24 h时MSCs上清液共培养组ECA109细胞OD值(0.743±0.059)低于对照组(0.881±0.026)(P=0.001),说明ECA109细胞增殖开始受到抑制；36 h时MSCs上清液共培养组OD值(1.034±0.206)明显低于对照组(1.729±0.458)(P=0.015),差异有统计学意义；培养48 h后，MSCs上清液共培养组ECA109细胞增殖仍然受到抑制作用，MSCs上清液共培养组OD值(1.069±0.254)显著低于对照组(1.718±0.520)(P=0.037)。

图2 MSCs表面标记的表达

表1 食管癌细胞ECA109划痕实验划痕面积统计表

表2 CCK-8检测MSCs上清液对ECA109细胞增殖的影响

图3 食管癌细胞ECA109划痕实验

2.4 MSCs上清液促进食管癌细胞ECA109的凋亡

流式细胞术检测结果显示(表3和图5),MSCs上清液共培养组细胞早期凋亡率(12.36±2.47)%高于对照组(7.23±0.86)%,细胞凋亡率显著增加(P=0.027);G2+S期MSCs上清液共培养组细胞比例(39.82±1.01)%相比对照组(55.17±9.60)%显著减少(P=0.049),可见细胞增殖减弱。提示MSCs上清液可以显著促进ECA109细胞凋亡，阻滞细胞分裂增殖。

图4 CCK-8法检测ECA109细胞增殖能力(*P<0.05)

图5 流式细胞仪检测ECA109细胞凋亡

表3 流式细胞仪检测ECA109细胞凋亡率及细胞周期

2.5 ERK、AKT、PI3K的表达

RT-PCR结果显示(表4),MSCs上清液共培养组AKT mRNA表达量(0.35±0.01)明显低于对照组(1.00±0.05),差异有统计学意义(P=0.004)。

Western blot结果显示(图6),MSCs上清液共培养组AKT蛋白和ERK蛋白与对照组相比表达显著下调，且差异有统计学意义(P<0.05),而PI3K蛋白表达无差异。

表4 RT-PCR检测相关基因mRNA表达量

图6 Western blot检测相关蛋白表达水平(*P<0.05)

3、讨论

MSCs是具有多种分化潜能和自我更新能力的成体干细胞，存在于许多不同的组织和器官中。MSCs 来源广泛，可从脐带、骨髓、脂肪组织、子宫内膜等处获取，其中人脐带来源的 MSCs 具有获取简便、免疫原性低，不需要进行有创操作等优点[7]。由于目前人脐带MSCs促肿瘤的文献鲜有报道，所以其近年来已成为研究的热点。有研究报道，人脐带MSCs与乳腺癌及肺癌细胞共培养可诱导癌细胞凋亡[8],与前列腺癌细胞共培养后可通过抑制基质金属蛋白酶的表达而抑制癌细胞的增殖和侵袭能力[9,10],其与骨髓瘤细胞共培养通过核因子-κB信号通路在对抗癌药物的生存、增殖和耐药中起着关键作用[11]。本实验收集培养人脐带MSCs的上清液，与食管癌细胞ECA109进行共培养，通过划痕实验和CCK-8实验发现食管癌细胞ECA109的增殖和迁移能力都明显下降；流式细胞检测发现MSCs上清液共培养组细胞凋亡数显著增加，MSCs上清液抑制ECA109细胞增殖、迁移能力，并促进其凋亡。MSCs对不同肿瘤发挥促进或抑制的作用，但具体机制并不清楚。

作为细胞生存的重要通路，PI3K/AKT信号通路对细胞存活、生长、增殖、代谢起着关键作用[12,13]。细胞质中的ERK参与调节细胞骨架形成，越来越多的研究报道提示ERK1/2信号通路在异常细胞增殖、肿瘤发展和基因表达中起着至关重要的作用[14,15]。且ERK通路参与胰腺癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭过程[16,17,18]。本实验通过分子生物学实验手段检测PI3K、AKT和ERK的mRNA及蛋白表达水平，结果显示MSCs上清液共培养组AKT的mRNA水平降低，AKT和ERK蛋白表达均降低，MSCs上清液可能对AKT及ERK的表达具有直接或间接的抑制作用。

MSCs上清液中含有MSCs培养过程中分泌的多种细胞因子，MSCs对肿瘤细胞发挥抑制作用可能是通过分泌某些因子作用于相关通路来实现的。外泌体是细胞通过旁分泌的纳米级(40～150 nm)双层膜结构的囊泡，囊泡内富含与母细胞相关的蛋白质、mRNAs和miRNAs等信号分子[19,20]。人脐带MSCs来源的外泌体可以转运核酸、脂质和蛋白质，参与细胞间的信息交流，具有与MSCs相似的组织损伤修复和再生功能[21,22]。MSCs在静息或活动状态下释放到细胞外的膜分泌体系，具有母细胞体外免疫调节作用的功能性膜性囊泡，称为MSCs来源外泌体。可以看出，MSCs分泌的外泌体具有与MSCs相似的生物学功能，是介导细胞间信息交流的重要因素，在肿瘤的增殖、迁移过程中扮演着重要角色。在本实验中MSCs上清液抑制食管癌细胞ECA109增殖、迁移能力是否是上清液中外泌体起关键作用，可后续进一步研究。为探索MSCs外泌体对食管癌细胞系ECA109的调控机制，推进MSCs外泌体成为食管癌治疗的新手段提供实验证据和理论依据。

综上所述，MSCs上清液能够显著抑制食管癌细胞ECA109增殖及迁移能力，促进ECA109细胞的凋亡，下调AKT、ERK蛋白的表达，因此我们认为MSCs上清液抑制食管癌细胞生长的作用与PI3K/AKT信号通路关键激酶AKT的表达及ERK蛋白的表达下调有关。

参考文献:

[10]黄磊,郑建金.脐带血间充质干细胞与肿瘤关系的研究进展[J].现代肿瘤医学,2017,25(6):966-968.

[13]徐利本,吴朝阳,王远东.PI3K/Akt信号传导通路在肿瘤发生发展及治疗中的作用[J].现代肿瘤医学,2021,29(1):177-180.

基金资助:新疆维吾尔自治区自然科学基金(编号:2021D01C290);

文章来源:许彭,张亚杰,马莉莉,等.培养间充质干细胞的上清液对食管癌细胞ECA109生物学行为的影响[J].现代肿瘤医学,2024,32(11):1967-1972.