首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 耳鼻咽喉科论文 > 头颈外科论文 > 创伤性颅脑损伤中神经功能障碍与认知功能损伤的动态变化

创伤性颅脑损伤中神经功能障碍与认知功能损伤的动态变化

2024-02-07 29 上传者：管理员

摘要：目的探讨创伤性颅脑损伤(TBI)模型小鼠神经功能与认知功能的动态变化及其机制。方法 60只12月龄Balb/c小鼠，分为对照组(10只)与TBI模型组(50只),根据模型构建时间将TBI模型小鼠分组为，模型1d组、3d组、7d组、14d组和28d组，共5个亚组，每组10只。实验第29天分别开展神经功能评分，跳台测试。测完后处死取材，用于免疫组织化学、炎性细胞因子含量、Western blotting检测。结果与对照组相比，模型组小鼠各个时期神经功能评分明显增加，在第7天达到峰值后降低。然而，各个时期，模型组小鼠跳台错误潜伏期低于对照组，跳台错误次数高于对照组，且没有明显变化。此外，与对照组相比，模型组小鼠各个阶段离子化钙结合适配分子1(IBA1)、趋化因子C-X3-C基元配体1(CX3CL1)、CX3C趋化因子受体1(CX3CR1)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、磷酸化核因子(p-NF)-κB表达明显增加，在第7天达到峰值，之后开始降低。与此同时，炎性细胞因子白细胞介素6(IL-6)与肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量先升高达到峰值，随后开始降低。然而，与对照组相比，模型组小鼠各个时期β淀粉样蛋白(Aβ)、p-Tau蛋白表达持续增加。结论 TBI致模型鼠小胶质细胞持续活化，与炎症反应一同先升高，再降低，导致小鼠神经功能评分到达峰值后降低。此外，炎症反应可能作为Aβ沉积与Tau蛋白磷酸化的启动子，导致小鼠认知功能损伤。

关键词：
免疫印迹法
创伤性颅脑损伤
小鼠
炎症反应
神经功能障碍
认知功能
加入收藏

创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury, TBI)具有较高的发病率和死亡率[1],它是由钝性创伤或机械能量传递造成的脑组织损害事件，如车祸、运动、暴力或爆炸都是主要原因[2]。近年来，车祸造成的轻度颅脑损伤案例呈上升趋势，这部分患者多伴有多种神经、认知和行为障碍，严重影响了日后的生活。

由于TBI发病机制复杂，包括原发性颅脑损伤与继发性颅脑损伤，TBI的治疗存在较大的局限性。原发性主要是外力直接作用于头部，造成包括脑挫裂伤、脑水肿、弥漫性轴索损伤和神经功能损伤等。继发性损伤通常与TBI后发生的分子机制有关，涉及神经递质释放、钙介导的损伤、基因激活、线粒体功能障碍、兴奋毒性、神经炎症、氧化损伤和细胞凋亡、死亡[3]。流行病学证据表明，TBI继发性损伤包括阿尔茨海默病、多发性硬化症、帕金森病和肌萎缩侧索硬化等神经退行性疾病[4]。然而，关于TBI发生后原发性相关的神经功能障碍与继发性损伤中认知功能障碍的动态变化尚鲜有报道。因此，本研究拟构建小鼠TBI模型，探讨TBI小鼠各个阶段神经功能与认知功能变化及其发生机制。

1、材料和方法

1.实验动物

60只雄性Balb/c小鼠，SPF级，12月龄，体重24～26 g。由川北医学院实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(川)2018-18。小鼠入组后饲养于SPF动物房中，动物使用许可证：SYXK(川)2018-076。维持房间内12 h/12 h昼夜循环，室内恒温(24±2)℃,湿度控制(55±5)%,保证充足的水源和食物。

2.实验试剂

抗离子化钙结合适配分子1(lonized calcium binding adapter molecule 1, IBA1)抗体、抗趋化因子C-X3-C基元配体1(chemokine C-X3-C-motif ligand 1, CX3CL1)、CX3C趋化因子受体1(CX3C chemokine receptor 1, CX3CR1)抗体，抗NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)抗体、抗磷酸化核因子κB(phosphor nuclear factor kappa B,p-NF-κB)抗体、抗β-淀粉样蛋白(amyloidβ,Aβ)抗体、抗Tau蛋白抗体、抗p-Tau抗体和抗β-actin抗体(英国Abcam公司，武汉博士德生物技术公司，北京博奥森生物技术公司);白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) ELISA试剂盒(杭州联科生物技术有限公司);BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)

3.实验仪器

电子颅脑损伤仪(北京世联博研科技有限公司);跳台设备(江苏赛昂斯公司，型号：SA202);生物显微镜(日本Olympus公司，型号：BX53);酶标仪(美国Thermo公司，型号：Fc);凝胶电泳装置(美国Biorad公司，型号：Mini-protean Tetra);化学发光成像仪(上海天能生物保健品有限公司，型号：5200)。

4.颅脑损伤模型构建方案

将小鼠分为对照组(10只)与模型组，模型组分为实验1 d组、3 d组、7 d组、14 d组和28 d组，共5个亚组，分别在第28天、第26天、第22天、第15天和第1天构建颅脑损伤模型，均在第29天处死各组小鼠，如图1所示。模型构建前禁食12 h, 2%戊巴比妥钠(2 ml/kg)腹腔麻醉小鼠，俯卧位固定于脑立体定位仪上。顶部皮肤消毒，正中切开，剥离骨膜，暴露右顶骨。以前囟点为原点，在前囟后3 mm、中线右侧2.5 mm处，用微型磨钻钻开直径为2 mm的骨窗，保持硬膜完整。将小鼠移到电子颅脑损伤仪(electric cortical contusion impactor, eCCI)操作台上，依照参考文献[5]中eCCI打击参数，构建重度TBI模型小鼠。设置打击参数打击速度3 m/s,深度3 mm。撞击杆撞击硬膜，使脑组织产生瞬间形变，造成局限性脑挫裂伤，保持硬膜完整。缝合头皮，置于笼中继续喂养。对照组小鼠在第1天麻醉，切开头皮和颅骨开窗，不损伤脑组织(图1)。

5.神经功能评分

参考改良的神经功能缺陷评分量表(modified neurological severity scales, mNSS)[6]对不同分组小鼠神经功能进行打分评定，0～18分。分数越高代表神经系统功能损害越严重，取不同3人测定结果后平均得到神经功能评分结果。

6.跳台测试

取跳台实验装置，训练时将小鼠放入通电的实验箱中适应5 min。训练结束3 h后开始测试，箱底通电，将小鼠放在平台上。观察前5 min内小鼠第1次从平台跳下所需的时间，计为跳台错误潜伏期，计算小鼠5 min内累积跳下平台次数，计为跳台错误次数。

7.免疫组织化学染色

取小鼠海马体，制备石蜡切片，厚约5μm。常规脱蜡、烤片，3%过氧化氢孵育，梯度乙醇水化。PBST洗涤，BSA封闭1 h。PBST洗涤，滴加兔抗小鼠IBA1抗体(1∶100),4℃孵育过夜。PBST洗涤，滴加生物素标记羊抗兔IgG(H+L),室温孵育20 min。PBST洗涤，滴加链霉菌抗生物素/过氧化物酶溶液，室温孵育20 min。PBST洗涤，滴加DAB溶液反应30 s,蒸馏水冲洗终止反应。光学显微镜(日本奥林巴斯公司，型号：DX51)下观察与摄片。

图1颅脑损伤模型构建方案

图2各组TBI模型小鼠神经功能评分与跳台测试指标

8. ELISA检测

取小鼠海马体，根据厂商说明书步骤，检测海马体组织PBS匀浆后上清液中总蛋白浓度(BCA法)和各种细胞因子(IL-6和TNF-α)浓度。完成样品与标准品的添加和孵育后，使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值，建立浓度/吸光度值标准曲线，将样品吸光度值带入标准曲线中获得海马组织样品中细胞因子含量。

9. Western blotting检测

取小鼠海马体，加入裂解液匀浆，12 000 r/min离心10 min取上清液，BCA法检测蛋白浓度，加入上样缓冲液，沸水浴使蛋白变性。每个凝胶样品孔加入10μg样品，设置电泳分离条件为30V/30 min, 90V/60 min,开始电泳。设置转膜条件为2 mA/60 min,将目标蛋白转移至PVDF膜上。PBST清洗，BSA封闭2 h。PBST清洗，滴加一抗，抗NLRP3抗体(1∶500)、抗p-NF-κB抗体(1∶1000)、抗NF-κB抗体(1∶1000)、抗CX3CL1抗体(1∶1000)、抗CX3CR1抗体(1∶1000)、抗Aβ1～42抗体(1∶1000)、抗Tau抗体(1∶1000)等稀释液，4℃孵育过夜。次日取出条带，PBST清洗，二抗孵育，HRP标记山的羊抗兔/鼠IgG(H+L)抗体(1∶2000),滴加发光液，化学发光成像仪中获得目标蛋白条带，Image J 6.0软件分析各组蛋白表达灰度值。

10.统计学分析

所有数据经SPSS 22.0统计学软件进行分析，以均值±标准差

表示，通过GraphPad Prism 7.0制图软件分析，采用单因素方差(One-Way ANOVA)分析，Tukey检验比较两组数据之间的差异，P<0.05时两组数据间差异具有统计学意义。

2、结果

1. TBI造成小鼠神经功能与认知功能损伤

与对照组相比，TBI模型1 d组小鼠在第1天神经功能评分增加(P<0.05),模型7 d组达到峰值，之后虽然不断降低，但仍明显高于对照组(P<0.05)。此外，在跳台测试中，与对照组相比，TBI模型组小鼠跳台错误潜伏期明显减少(P<0.05),而跳台错误次数明显增加(P<0.05),且各组之间差异不明显(图2)。

2. TBI诱导小鼠脑组织中炎性细胞因子释放增加

与对照组相比，TBI模型造成小鼠海马体中炎性细胞因子IL-6与TNF-α含量明显增加(P<0.05),模型7 d组达到峰值。虽然，与模型7 d组相比，模型14 d组和28 d组小鼠IL-6与TNF-α含量降低，但仍明显高于对照组(P<0.05,图3)。

3. TBI诱导小鼠小胶质细胞活化

与对照组相比，TBI模型小鼠脑组织中IBA1表达明显升高(P<0.05),模型7 d组达到峰值。虽然与模型7 d组相比，模型14 d组和28 d组小鼠脑组织中IBA1表达降低，但是仍明显高于对照组(P<0.05)。此外，与对照组相比，TBI模型组构建后，NLRP3、p-NF-κB、CX3CL1与CX3CR1表达都明显增加(P<0.05),模型7 d组达到峰值，之后这些蛋白表达均出现降低(图4)。

图3 ELISA试剂盒检测各组TBI模型小鼠海马体中炎性细胞因子水平

图4各组TBI模型小鼠海马体小胶质细胞活化标志蛋白的表达

4. TBI诱导小鼠p-Tau、Aβ蛋白释放增加

与对照组相比，模型1 d组和3 d组小鼠Aβ1～42与p-Tau蛋白表达在前3 d没有明显变化，模型7 d组，小鼠脑组织中Aβ1～42蛋白开始沉积，p-Tau蛋白表达明显增加(P<0.05,图5)。

图5 Western blotting检测各组TBI模型小鼠海马体中Aβ1～42、p-Tau蛋白表达

3、讨论

临床上常见的TBI病例多发生于交通意外、重物袭击、失足坠落等事故。在此过程中，患者大脑多数受到瞬间外力冲击，遭受机械伤害。因此，TBI动物模型构建方式应尽量与临床TBI病例发生过程相吻合。本研究采用eCCI仪器通过撞击硬膜法构建TBI模型。该模型撞击操作简单，重复性好，小鼠死亡率较低，且症状明显，有利于我们的实验开展[6]。研究结果显示，TBI模型构建后的不同时间，小鼠的神经功能评分明显升高，跳台错误时间潜伏期都明显缩短，而跳台错误次数明显增加。然而，相比于前7 d, TBI小鼠的神经功能评分在14 d与28 d都出现一定程度降低，但跳台错误潜伏期与错误次数却没有改变。

在中枢神经系统中，炎症反应是指固有免疫细胞，包括小胶质细胞与星形胶质细胞，在组织损伤或病原体入侵过程中激活。小胶质细胞功能类似于外周系统中的巨噬细胞，激活后会诱发炎症反应，一方面可以促进神经组织修复，另一方面也会加重继发性损伤[7]。这些主要取决于免疫反应持续的时间和级联反应的程度[8]。已有研究指出，TBI小鼠的神经功能评分升高，出现神经功能障碍可能是小胶质细胞过度激活的结果[9]。通过提高自噬反应能够减轻小胶质细胞活化，改善微血管内皮细胞损伤，发挥抗TBI继发性损伤的作用[10]。本研究结果显示，小鼠脑组织中IBA1、CX3CL1、CX3CR1表达与NLRP3、p-NF-κB表达在TBI模型构建后第7天到达峰值，炎性细胞因子TNF-α、IL-6含量在实验第7天也到达峰值。IBA1作为小胶质细胞特异性的钙结合蛋白，参与小胶质细胞吞噬过程中胞膜褶皱的形成[11]。而CX3CR1则是一类趋化因子受体，存在于小胶质细胞表面，被神经元分泌的CX3CL1激活，反映了小胶质细胞活化[12]。与此同时，随着时间推移，小鼠自体免疫系统的适应性调节发挥了抗炎作用[13]。小鼠脑组织中IBA1、CX3CL1、CX3CR1表达与NLRP3、p-NF-κB表达在达到峰值后逐渐减少，TNF-α与IL-6含量逐渐降低。此外，模型组小鼠神经功能评分在7 d达到峰值后，在14 d与28 d也出现了降低。由于NLRP3与p-NF-κB是小胶质细胞活化后诱发炎性细胞因子释放的信号通路，与炎性细胞因子IL-6,TNF-α共同反映了炎症反应的激活[14]。因此，小鼠的神经功能评分与炎症反应相关。以上结果提示，TBI模型造成小胶质细胞过度活化，诱发过量的细胞因子释放，导致小鼠神经功能损伤。模型构建14 d后，自体免疫系统抑制了小胶质细胞活化，虽然降低了炎性细胞因子含量，但仍高于对照组，促进了神经组织修复，改善了小鼠的神经功能。

有研究认为，小胶质细胞活化诱发的炎症反应是小鼠认知功能损伤的主要原因[15]。然而，本研究中，小鼠TBI模型构建14 d后，虽然小胶质细胞活化与炎性细胞因子释放降低，但跳台错误潜伏期与跳台错误次数却没有明显改变。这提示TBI模型存在其他机制诱发认知功能损伤。由于本研究使用的是老龄小鼠，其他研究早已报道，老龄小鼠经历脑部损伤更易并发阿尔茨海默病[16]。行为学上表现为水迷宫实验中绕着水迷宫四周无目的旋转或跳台测试中多次的错误行为，病理表现为过度沉积的Aβ蛋白与过度缠结磷酸化的Tau蛋白[17]。本研究结果显示，小鼠TBI模型构建14 d后，脑组织内Aβ沉积与p-Tau蛋白表达持续增加。由于Aβ与p-Tau蛋白是阿尔茨海默病患者的标志性蛋白，与认知功能障碍成正相关。因此，本研究中模型1 d组、3 d组、7 d组小鼠跳台错误潜伏期与跳台错误次数没有明显变化可能是由炎性细胞因子过量释放造成的，而14 d以后则可能是由Aβ与p-Tau蛋白过度表达造成，且炎症反应在Aβ与p-Tau蛋白过度表达中可能发挥启动子的作用。

综上所述，本研究发现TBI模型小鼠脑组织中小胶质细胞活化与炎症反应先激活，达到峰值后降低，介导小鼠神经功能评分先增加，再减少。此外，炎症反应可能作为Aβ沉积与Tau蛋白磷酸化的启动子，造成小鼠Aβ、p-Tau蛋白过度表达，诱导持久的认知功能损伤。然而，由于本实验研究对象是老龄小鼠，出现Aβ过度沉积与Tau蛋白磷酸化风险较大。需要进一步比较成年与老龄小鼠TBI模型构建后行为学与病理学特征，以确定炎症反应与Aβ、p-Tau蛋白过度表达在神经功能与认知功能中的作用。

参考文献:

[1]张宇,薛茜,宋笑雨,等.壳聚糖包载人脐带间充质干细胞对创伤性脑损伤大鼠的治疗作用及机制[J].解剖学报,2021,52(2):205-209.

基金资助:四川省医学(青年创新)科研课题项目(SZ0081);

文章来源:邹成功,冯浩,陈兵等.创伤性颅脑损伤中神经功能障碍与认知功能损伤的动态变化[J].解剖学报,2024,55(01):43-48.