支气管哮喘是临床上很常见的肺部疾病。过敏性哮喘是其常见的一种类型，主要由过敏原引起，多种炎性细胞参与的气道变态反应性疾病。尘螨是引起哮喘重要的过敏原之一，哮喘患者中80%以上对尘螨过敏[1]。人们对于哮喘发病机制的认识至今仍不完全清楚，普遍认为关键机制是Th1/Th2比例失衡[2,3]。随着研究的不断深入，人们发现气道的抵御屏障在哮喘的发病过程中起着至关重要的保护作用[4]。气道上皮密切暴露于外界环境中，是抵御伤害刺激的第一道防线，具有重要的物理屏障和调节过敏反应的作用[5]。该屏障的保护作来源于气道上皮间的顶端连接复合物以及表面的黏液层[6]。顶端连接复合物主要由紧密连接蛋白(occludin、claudins)组成[7],在调控上皮细胞周围的通透性及维持稳定的肺微环境中起重要作用[8];正常情况下的黏液层则具有润滑和防御细菌病毒入侵等保护作用。大量研究证实哮喘患者的气道上皮屏障完整性受损且存在明显的功能障碍[9,10]。

草乌甲素(Bulleyaconitine A,BLA)是一种从乌头碱植物中提取的高活性生物碱[11],多项实验研究表明其具有明显的镇痛、抗炎以及免疫调节等作用[12,13]。前期的研究表明，BLA可通过激活PKC-δ/NF-κB信号通路缓解卵清蛋白(OVA)诱导的哮喘小鼠气道炎症[14]。但BLA对粉尘螨诱导的过敏性哮喘气道上皮的影响，尚未见文献报道。本研究旨在通过检测BLA对粉尘螨诱导的过敏性哮喘小鼠气道上皮紧密连接蛋白occludin、claudins以及黏蛋白5AC(MUC5AC)的表达，探讨BLA治疗哮喘的可能机制，为临床治疗哮喘药物的筛选提供新的途径。

一、材料与方法

1 材料

1.1 实验

动物4周龄SPF级BALB/c雌鼠48只，体重18～22 g, 购自河南斯克贝斯公司。

1.2 主要试剂

粉尘螨提取浸液，含量为9.742 mg/mL(本实验室制备);草乌甲素标准品和[Al(OH)3]购自上海源叶公司；BCA蛋白定量试剂盒、HRP山羊抗兔二抗、ECL显色试剂盒和IgE、IL-4、IFN-γ ELISA试剂盒(Biosharp);MUC5AC ELISA试剂盒(泉州睿信生产);兔抗小鼠occludin、claudin-1、claudin-4和 β-actin抗体(北京博奥森生产);引物(上海生工生产);HE和PAS染色试剂盒、RIPA裂解液和PMSF(南京碧云天生产);总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和SuperReal荧光定量试剂盒(北京天根生产)。

1.3 主要仪器设备

402AI型超声雾化仪(江苏鱼跃产品);超纯水仪(美国Millipore产品);组织研磨仪(上海净信产品);化学发光成像仪(美国Bio-Rad产品);多功能酶标仪(瑞士TECAN);荧光定量PCR仪(瑞士Roche)。

2 方法

2.1 制备小鼠哮喘模型

小鼠随机分为4组：NC组，AS组，BLA组和Dex组，一组12只。参考文献[14]造模方法作为参照，以粉尘螨提取浸液构建哮喘小鼠模型。BLA组和Dex组给药剂量分别为0.48 mg/kg和1 mg/kg。

2.2 血清IgE水平测定

粉尘螨提取浸液末次激发24 h后，每组随机选6只眼眶取血，静置30 min, 4 ℃ 3 000 r/min(离心半径7.7 cm)离心10 min, ELISA检测上清IgE含量。

2.3 支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中IL-4、IFN-γ和MUC5AC水平测定

末次激发24 h后，每组取6只腹腔注射200 μL的5%水合氯醛麻醉，参照文献[14]收集BALF,ELISA检测上清IL-4、IFN-γ和MUC5AC的含量。

2.4 肺组织HE和PAS染色

分离上述步骤小鼠肺组织，浸泡于4%的多聚甲醛24 h, 经包埋脱水后做常规石蜡切片，进行HE和PAS染色。

2.5 蛋白免疫印迹(Western blot)实验

分离小鼠肺组织，存于-80 ℃冰箱。每组称取25 mg肺组织，提取总蛋白。蛋白浓度的检测采用BCA法。提取的蛋白经12% SDS-PAGE电泳后转膜，以marker的分子量为对照，裁取目的蛋白所在区域的PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h, 分别置于对应的一抗中孵育过夜，孵育温度为4 ℃。TBST漂洗3次，于室温下孵育二抗1 h, 洗膜后进行ECL显色曝光。Image J分析条带灰度值，β-actin作为目的蛋白的内参对照。

2.6 免疫荧光实验

取2.4步骤中4 μm石蜡切片于60 ℃烘箱脱蜡后，置于煮沸的枸橼酸盐中进行抗原修复，冷却后PBS漂洗3次，滴加5%牛血清蛋白室温封闭1 h, 分别与对应的一抗孵育过夜，孵育温度为4 ℃,于室温下孵育二抗1 h, 漂洗后DAPI荧光封片剂避光封片，荧光显微镜下观察。

2.7 RT-qPCR检测MUC5AC mRNA的表达

取小鼠肺组织提取总RNA。以mRNA为模板，逆转录合成cDNA进行PCR扩增。参考文献[15]合成β-actin和MUC5AC的引物序列，数据处理采用2-ΔΔCt法。

2.8 统计分析

统计学分析采用SPSS软件，结果以均数±标准差表示，组间样本的均数比较采用单因素方差分析(LSD-t或Thamhane’s T2),P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1 哮喘小鼠行为学表现

AS组小鼠每次雾化时都表现出不同程度的哮喘速发症状，比如抓耳挠背、打喷嚏、烦躁不安、呼吸频率增加等；NC组小鼠活动自如，未见明显异常。BLA组和Dex组小鼠上述哮喘症状明显减轻，活动尚可。

2 小鼠血清总IgE水平

ELISA法检测结果显示，NC组、AS组、BLA组和Dex组的血清总IgE水平分别为(69.85±15.26)ng/mL、(306.70±46.73)ng/mL、(142.17±25.66)ng/mL和(160.58±34.78)ng/mL。与NC组相比，AS组IgE抗体含量明显升高(P<0.01);与AS组相比，BLA组和Dex组IgE含量明显降低(P<0.01)(图1A)。

3 小鼠BALF中IL-4和IFN-γ表达水平

ELISA法检测结果显示，NC组、AS组、BLA组、Dex组的IL-4水平分别为(114.94±16.75)pg/mL、(242.35±41.81)pg/mL、(166.76±26.32)pg/mL、(185.62±29.36)pg/mL。AS组较NC组IL-4水平明显升高(P<0.01);BLA组和Dex组可显著降低AS组IL-4表达水平(P<0.01)(图1B);NC组、AS组、BLA组、Dex组的IFN-γ表达水平分别为(497.65±42.68)pg/mL、(272.34±57.32)pg/mL、(369.13±51.41)pg/mL、(398.59±33.35)pg/mL。AS组较NC组IFN-γ水平明显降低(P<0.01);BLA组和Dex组可显著升高AS组IFN-γ表达水平(P<0.01)。

4 小鼠肺组织病理变化

HE染色结果显示，NC组小鼠肺组织内仅有少量炎症细胞浸润，支气管壁与肺泡上皮细胞结构完整，未见明显水肿和充血；AS组小鼠气道可见明显炎症细胞浸润，支气管上皮细胞严重脱落，支气管壁呈现不同程度的水肿，塌陷等破坏；BLA组和Dex组小鼠气道炎症反应较AS组明显改善，嗜酸性粒细胞浸润明显减少以及支气管壁破坏程度显著下降等。

PAS染色结果显示，NC组小鼠管腔黏膜完整，未见明显杯状细胞增生和黏液分泌增多；AS组小鼠可见大量增生的杯状细胞，管腔内黏液分泌物明显增多；BLA组和Dex组小鼠黏膜均较为完整，杯状细胞增生程度较AS组明显减少，管腔内仅有少量黏液分泌(图2)。

图1 小鼠血清总IgE及肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ的含量   

图2 小鼠肺组织病理变化(200×)   

5 小鼠肺组织occludin、claudin-1及claudin-4的蛋白表达

Western blot结果显示，AS组较NC组occludin、claudin-1蛋白表达明显下降，claudin-4表达显著提升，差异均具有统计学意义(P<0.01);BLA组与AS组相比较，occludin、claudin-1蛋白表达显著提升(P<0.05),claudin-4表达显著降低(P<0.05);Dex组与AS组相比，occludin蛋白表达也呈现明显的提高(P<0.01),而claudin-1和claudin-4蛋白表达与AS组相比差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。

图3 小鼠肺组织occludin、claudin-1和claudin-4蛋白表达情况  

免疫荧光结果显示，NC组occludin、claudin-1及claudin-4蛋白在小鼠气道上皮细胞表面和细胞内均有大量表达，排列完整有序及紧密；AS组小鼠气道上皮屏障完整性被破坏，occludin和claudin-1蛋白表达量较NC组明显减少，且排列松散无序，claudin-4蛋白表达量较NC组明显增多；与AS组相比较，BLA治疗后小鼠气道上皮完整性在一定程度上得到改善，occludin和claudin-1表达量明显提高，排列也相对完整和紧密，claudin-4表达量也明显减少(图4)。

图4 肺组织occludin、claudin-1、claudin-4蛋白表达(免疫荧光，200×)  

6 小鼠BALF中MUC5AC的水平及肺组织Muc5ac mRNA的表达

ELISA结果显示，NC组、AS组、BLA组和Dex组的MUC5AC水平分别为(0.49±0.11)ng/mL、(1.42±0.34)ng/mL、(0.66±0.24)ng/mL、(0.90±0.26)ng/mL。与NC组相比，AS组MUC5AC水平明显升高(P<0.01);BLA和Dex治疗后可显著降低AS组MUC5AC水平(P<0.01)(图5A)。

图5 小鼠MUC5AC的含量及mRNA表达   

三、讨论

哮喘是一种气道炎症性疾病，气道上皮先天性的免疫缺陷和面对各种损伤时的反应是哮喘疾病起源和进展的关键，气道上皮信号通路紊乱不仅导致了哮喘的易感性，还导致了哮喘的气道炎症和气道重塑[16]。气道上皮物理屏障的完整性由上皮细胞间的连接构成，其中紧密连接位于上皮细胞间隙表面的最顶端部位，可调节细胞旁通透性[17],是细胞间最基本和最常见的组织结构形式。紧密连接主要由occludin, claudins, ZO-1/2,cingulin等蛋白组成[18]。Xiao等[19]发现哮喘患者的气道上皮occludin蛋白分布明显不规则，细胞间严重缺乏，导致气道的紧密连接完整性中断。Jia等[20]发现当敲除claudin-1基因时，会加重屋尘螨诱导的哮喘小鼠气道炎症反应。有研究表明严重哮喘模型的气道上皮细胞出现明显的脱落和死亡，且occludin和claudin-1蛋白的表达被显著降解，进一步阐述了occludin, claudin-1蛋白在维持气道上皮细胞完整性中的重要性[21]。与之不同的是claudin-4可能在肺泡上皮中代表一种促进肺泡液清除的保护性反应蛋白[22,23]。Lee等[24]发现哮喘小鼠气道紧密连接被破坏的同时claudin-4 mRNA和claudin-4蛋白表达增加，在敲除claudin-4基因后，Der p1诱导的抗炎细胞因子IL-4、中文IL-5、中文IL-13表达也明显提高。

本研究通过构建粉尘螨哮喘小鼠模型，给予BLA治疗后发现小鼠呼吸急促、点头呼吸、抓耳挠背等哮喘速发症状明显减轻；ELISA检测发现BLA可显著降低哮喘小鼠IgE抗体、IL-4以及提高IFN-γ的含量；肺部病理切片显示BLA可明显改善哮喘小鼠气道炎症细胞浸润，杯状细胞增生和黏液分泌增多等病理特征，对哮喘起到了一定的治疗作用。进一步研究发现BLA可提高哮喘小鼠肺组织occludin、claudin-1蛋白表达，以及降低claudin-4蛋白表达，在一定程度上恢复了上皮细胞紧密连接的完整性，提示BLA治疗哮喘小鼠的机制与气道上皮紧密连接蛋白occludin、claudin-1上调以及claudin-4下调有关。上述结果表明，BLA对哮喘小鼠气道上皮细胞紧密连接的完整性可能具有一定的保护作用。

气道黏液分泌增多也是哮喘患者重要的病理特征之一。在健康人群的气道中仅分泌少量的黏液，这些少量黏液不仅可以清除沉积在呼吸道内的颗粒物，还可以作为抗菌物质和溶菌酶，在维持呼吸道正常的生理过程中起着至关重要的作用[25,26]。但当黏液分泌过多不能及时清除时，可能会造成呼吸道堵塞[27]。气道黏液的主要成分是黏蛋白，MUC5AC是其重要组分[28]。研究表明，MUC5AC不仅能引起黏液阻塞，还参与气道的高反应性[29]。因此，抑制哮喘炎症期间主要表达上调的黏蛋白的产生，对急性和重型哮喘的治疗有重大帮助。本实验结果表明哮喘小鼠MUC5AC含量和Muc5ac mRNA的表达明显高于正常组。给予BLA治疗后BALF中的MUC5AC含量明显减少，肺组织中的Muc5ac mRNA表达也明显降低。结果提示BLA治疗哮喘小鼠的机制可能与降低MUC5AC的含量以及下调Muc5ac mRNA的表达有关。

综上，BLA可通过恢复气道上皮的紧密连接结构，以及降低黏蛋白的表达修复受损的气道屏障，这可能是BLA缓解哮喘气道炎症，改善哮喘气道重塑的作用机制之一。

参考文献:

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[17]李佳,高金明.气道上皮功能障碍在哮喘发病机制中的作用[J].中华临床免疫和变态反应杂志,2023,17(1):38-44.

[26]辛云卓,宋东,谢笑多,等.细粒棘球绦虫抗原Fis1T细胞表位肽缓解过敏性哮喘小鼠气道炎症的免疫学作用研究[J].中国病原生物学杂志,2024,19(1):47-51,55.

基金资助:安徽省高校自然科学重点基金(No.KJ2018A0263);一种植物来源的具有除螨去屑功效的洗发水研发(No.H202106);

文章来源:宋乔文,许月野,郭伟,等.草乌甲素对哮喘小鼠治疗作用及其机制研究[J].中国病原生物学杂志,2024,19(04):441-445+449.