功能性消化不良导致的腹痛、腹胀及急、慢性腹泻等病症是消化门诊常见的病症之一，由于此类疾病无明确的典型性的器质病变，西医药技术主要采用抗幽门螺旋杆菌制剂、黏膜保护剂及促胃肠动力剂等药物帮助患者缓解症状，由于西药在长期或大量服用后的毒副作用及疾病的极易再次复发等问题的涌现，临床医师将研究重点投向传统中医药方面。研究显示大多的功能性消化不良症状归属于“脾胃虚寒”症候，而中医药在对脾胃虚寒的治疗的方面积累了大量的经验[1]。历代中医药名家在“温中散寒”“健脾理气”等方针的指导下，形成了理中汤、香砂六君子汤、艾灸、丁桂儿脐贴等方剂和治疗方法，并在临床取得了满意的疗效。出自《金匮要略》的黄芪建中汤由黄芪、白芍、生姜、桂枝、甘草、大枣、饴糖等中药材组成，有升阳散寒、滋肝止痛之效，对脾胃虚寒症具有良好的疗效[2]。但是由于其中的机制尚未阐明，严重地限制了该方的推广应用。中医认为脾胃虚寒以影响营养物质的消化、吸收及代谢为主，是导致“综合系统的功能层次”下胃肠功能紊乱的重要原因[3]。作为主要的消化器官，肠黏膜结构和功能的完整是肠道具备消化和吸收功能的重要基础。肠黏膜的机械、化学、免疫和生物4大屏障，不仅是帮助肠道完成对营养的吸收，还能防御有害致病微生物及致炎因子的侵袭，是人体内重要的一条功能隔离带[4]。创伤、烧伤、炎症、失血、感染、长期的抗生素和免疫抑制剂的干预等因素均可导致肠黏膜屏障损伤。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ属于核受体超家族中的一员，该信号的传导与细胞的物质代谢、细胞分化与衰老、炎性应激等生物学过程关系密切[5]。Chimienti等[6]研究指出在肠易激综合征大鼠模型中，激活PPARγ信号能明显改善实验动物肠黏膜的超微结构损伤，抑制炎症的扩散。但是有关该信号在脾胃虚寒肠黏膜中的作用的报道较少。本研究构建脾胃虚寒大鼠模型，采用RNA干扰PPARγ表达，探讨黄芪建中汤对模型动物肠黏膜的保护机制。

1、材料和方法

1.1 试验动物、主要试剂及仪器

SPF级，SD大鼠，雄性，5～6周龄，体质量(180±20)g, 购自北京百奥赛因基因生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2020-0007,在温度(25±2)℃,湿度(45±5)%,12 h/12 h交替光暗周期的饲养条件下适应性喂养后用于实验[使用许可证号：SYXK(冀)2019-006]。本研究已经医院的动物委员会批准(JHS-5S2021-0321ED),并在操作过程中，严格遵循3R的原则，给予动物人道主义关怀，尽可能最大限度地减少动物的伤亡。

黄芪建中汤(主要由黄芪5 g、白芍18 g、生姜9 g、桂枝9 g、甘草6 g、大枣12 g及饴糖40 g等药材组成),准确称取各生药饮片，将黄芪、白芍、生姜、桂枝、甘草、大枣按质量以10倍纯净水温水浴浸泡2 h, 电热套加热回流提取两次，第一次加10倍的纯净水，第二次加8倍的纯净水，每次煎煮时间为1.5 h, 合并两次提取液烊化饴糖，浓缩药液至含生药量1.5 g/ml待用。干扰PPARγ的RNA表达的siRNA-PPARγ(正向引物：5′-TTTTCAAGGGTGCCAGTTTC-3′,反向：5′-AATCCTTGGCCCTCTGAGAT-3′)和siRNA-PPARγ-NC(正向引物：5′-TGTTGGC ATCCTGCTATCTG-3′,反向：5′-AGGGAAAGCTTTGGGGTCTA-3′)由合力众盈(北京)生物科技基因工程技术中心设计完成。

多聚甲醛(北京索莱宝生物科技有限公司，生产批号：078521),兔抗大鼠三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体(上海碧云天生物科技有限公司，生产批号：SH-R3-8B),苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(武汉博士德生生物公司，生产批号：YR-6UM2),酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(生产批号：EB-3554)、免疫组化(生产批号：EBO9M2)、Western印迹试剂盒(生产批号：EB-V6G8I)(上海卧宏生物科技有限公司),兔抗大鼠PPARγ(生产批号：AB-5T33)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1,生产批号：AB-2C8J)和紧密连接蛋白(Claudin)-1抗体(生产批号：AB-XKL03R,美国abcam公司)。CM1950冰冻切片机(德国Leica公司),Countstar Rigel S2流式细胞仪(上海瑞珏生物科技有限公司),Tundra 冷冻透射电子显微镜(Cryo-TEM,荷兰赛默飞世尔科技有限公司),REBEL 2 IN 1正置/倒置Hybrid显微镜(美国Discover ECHO公司),ZF-288全自动凝胶成像系统(上海嘉鹏科技有限公司)。

1.2 动物模型的构建

根据闫君等[1]方法：每日上午以10 ml/kg的4 ℃低温3.5%醋酸溶液进行灌胃，每日下午以10 ml/kg的精炼动物脂肪油进行灌胃，连续处理10 d后，大鼠出现肢体温度明显降低，大便稀溏，慵懒少动等现象视为造模成功。

1.3 分组处理[7]

实验动物随机分为正常组、模型组、中药组(Model+黄芪建中汤)和抑制剂组(Model+黄芪建中汤+siRNA-PPARγ),其中，正常组在造模过程中均以等剂量的生理盐水进行灌胃。模型组、中药组和抑制剂组在造模结束后，中药组每日腹腔注射5×109 pfu/ml的siRNA-PPARγ-NC,并且以10 ml/kg的黄芪建中汤灌胃，抑制剂组每日腹腔注射5×109 pfu/ml的siRNA-PPARγ,并且以10 ml/kg的黄芪建中汤灌胃，模型组和正常组每日腹腔注射5×109 pfu/ml的siRNA-PPARγ-NC,并且以10 ml/kg的等剂量的生理盐水灌胃，每日给药1次，连续处理28 d, 期间大鼠均单笼饲养，自由饮水与摄食。

1.4 各组一般状况及血清指标的监测

在实验过程中，每日记录大鼠进食与饮水情况、精神状态，活动量、皮毛状态等日常行为参数。末次给药结束后，将大鼠禁食不禁水12 h, 尾静脉留取5 ml血液标本，离心后留取上清，ELISA检测各组血清肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6含量。

1.5 各组结肠组织的病理损伤及评分

采血完毕处死大鼠，无菌剖取各组结肠组织，观察各组大鼠结肠黏膜的状态；以4%多聚甲醛将结肠组织固定，包埋，切片，脱蜡，按HE试剂盒要求，依次苏木素进行核染，伊红进行胞质染色，中性树胶封片；镜检。并由两位病理研究人员采用双盲法对各组大鼠的结肠损伤病理进行评分[8]:炎症的严重程度(0分：固有层中的罕见炎症细胞；1分：固有层中粒细胞数量增加；2分：炎性细胞汇合延伸到黏膜下层；3分：炎性浸润的透壁扩展);隐窝损伤(0分：完整的隐窝；1分：1/3基底缺失隐窝；2分：2/3基底隐窝消失；3分：整个隐窝消失；4分：上皮表面改变，侵蚀；5分：融合侵蚀);溃疡(0:无溃疡；1分：1或2个溃疡病灶；2分：3、4个溃疡病灶；3分：融合性或广泛性溃疡)。3个维度的积分叠加后即为大鼠结肠组织的病理损伤评分。

1.6 各组结肠组织超微结构

取大鼠的结肠组织，经3%戊二醛固定，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，1%锇酸再固定，脱水，包埋，制成超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双染色，Tundra 冷冻透射电子显微镜下观察。

1.7 各组结肠组织的杯状细胞数量的比较

以4%多聚甲醛将结肠组织固定，梯度浓度乙醇溶液脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成约5 μm的切片，脱蜡，PBS冲洗3次，过碘酸雪夫(PAS)避光室温染色30 min, 苏木素复染，脱水后，中性树胶封片；显微镜下观察各组结肠组织中杯状细胞的状态数量，ImageJ软件进行统计分析。

1.8 各组结肠组织的细胞凋亡

取大鼠的结肠组织，常规固定，剪碎，冲洗，低速离心，制成单细胞悬液，Countstar Rigel S2型流式细胞仪检测卵巢组织的细胞凋亡率。

1.9 各组结肠组织中ZO-1和Claudin-1表达

取大鼠的结肠组织，经甲醛固定，石蜡切片，脱蜡，梯度乙醇脱水，抗原修复，牛血清白蛋白封闭，依次加入一抗(1∶200)、二抗(1∶1 000),PBS洗涤，苏木素复染，封片后，显微镜下观察，视野中出现棕黄色颗粒表示目的蛋白表达。

1.10 各组结肠组织PPARγ表达

取各组结肠组织，在4 ℃裂解液中放置30 min, 离心，并将上清液稀释，常规方法提取样本中的总蛋白，以50 μg样品进行上样，电泳后，转模，封闭，加入一抗(1∶1 000),二抗(1∶5 000)稀释后，室温孵育后，显色30 min, 以GAPDH为参照，分析目标蛋白的灰度值。

1.11 统计学方法

采用SPSS26.0软件进行方差分析、t检验。

2、结果

2.1 各组一般状态及血清指标比较

在实验过程中，正常组精神状态良好，活动量较大，反应敏捷，皮毛柔顺且有光泽，嘴巴、舌、四肢及趾甲颜色淡红，进食与饮水量无异常，二便正常，大便软硬适中，体质量增加较为明显；模型组出现明显的精神不振现象，喜弓背，几乎不活动，反应迟钝，皮毛干枯杂乱，食欲欠佳，嘴巴、舌、四肢及趾甲颜色呈现淡白色，大便稀溏甚少成形，体质量增加不明显，形体消瘦；中药组临床明显改善；抑制剂组临床症状比中药组改善程度较差。与正常组相比，模型组、中药组、抑制剂组血清中TNF-α、IL-6含量明显升高(均P<0.05);与模型组相比，中药组、抑制剂组血清中TNF-α、IL-6含量明显降低(均P<0.05);与中药组相比，抑制剂组血清中TNF-α、IL-6含量明显升高(均P<0.05),见表1。

表1 各组血清TNF-α、IL-6含量

2.2 各组结肠组织中PPARγ表达

与正常组相比，模型组、中药组、抑制剂组结肠组织中PPARγ表达明显下降(P<0.05);与模型组相比，中药组、抑制剂组结肠组织中PPARγ表达明显升高(P<0.05);与中药组相比，抑制剂组结肠组织中PPARγ表达明显降低(P<0.05),见图1、表2。

2.3 各组结肠组织损伤病理的变化

HE染色显示，正常组结肠黏膜各层细胞排列整齐，上皮层、固有层、肌层、浆膜层及黏膜肌层、黏膜下层分层清晰，未见异常，肠微绒毛正常，大肠腺结构清晰，分布丰富；模型组黏膜各层出现不同程度的或断裂或缺损或水肿，黏膜层萎缩严重，固有层炎性细胞大量浸润，肠微绒毛或脱落或丢失，大肠腺明显萎缩；中药组结肠黏膜损伤较模型组明显改善，炎性浸润明显缓解，微绒毛结构趋于正常；抑制剂组结肠黏膜损伤较中药组明显加重，浸润的炎性细胞数量较中药组明显增多，较模型组明显减少。与正常组相比，模型组、中药组、抑制剂组结肠组织黏膜损伤评分明显升高(P<0.05);与模型组相比，中药组、抑制剂组结肠组织黏膜损伤评分明显降低(P<0.05);与中药组相比，抑制剂组结肠组织黏膜损伤评分明显升高(P<0.05),见表2、图2。

2.4 各组结肠组织杯状细胞数量的变化

正常组黏膜组织的杯状细胞结构正常，形态圆润，黏蛋白的分泌量较为丰富；模型组结肠组织的杯状细胞萎缩严重，黏蛋白的分泌量较少；中药组结肠组织的杯状细胞的损伤明显缓解，黏蛋白的分泌量有所回升；抑制剂组结肠组织的杯状细胞的损伤较实验组明显加重，见图3。与正常组相比，模型组、中药组、抑制剂组结肠组织中的杯状细胞数量明显减少(P<0.05);与模型组相比，中药组、抑制剂组结肠组织中的杯状细胞数量明显增多(P<0.05);与中药组相比，抑制剂组结肠组织中的杯状细胞数量明显减少(P<0.05),见表2。

2.5 各组结肠组织的细胞凋亡

与正常组相比，模型组、中药组、抑制剂组细胞凋亡率明显升高(P<0.05);与模型组相比，中药组、抑制剂组细胞凋亡率明显降低(P<0.05);与中药组相比，抑制剂组细胞凋亡率明显升高(P<0.05),见表2、图4。

2.6 各组结肠组织中ZO-1和Claudin-1表达

与正常组相比，模型组、中药组、抑制剂组结肠组织中ZO-1和Claudin-1阳性细胞比例明显降低(P<0.05);与模型组相比，中药组、抑制剂组结肠组织中ZO-1和Claudin-1阳性细胞比例明显升高(P<0.05);与中药组相比，抑制剂组结肠组织中ZO-1和Claudin-1阳性细胞比例明显降低(P<0.05),见表2、图5。

图1 各组结肠组织中PPARγ表达   

表2 各组结肠组织损伤病理评分、杯状细胞数量、细胞凋亡率、ZO-1和Claudin-1、PPPAR

图2 各组结肠组织损伤(HE染色，×400)   

图3 各组结肠组织杯状细胞数量(PAS染色，×400)   

图4 各组结肠组织细胞凋亡   

图5 各组ZO-1和Claudin-1表达(免疫组化，×400)

2.7 各组结肠组织超微结构的变化

电镜观察结果显示，正常组结肠黏膜中的细胞结构无异常，黏膜无扩张，无水肿，线粒体及其他细胞器均清晰可辨，胞间连接紧密，肠微绒毛排列整齐；模型组结肠黏膜的超微结构损伤严重，细胞内各细胞器出现不同程度的肿胀、扩张，核仁固缩严重，细胞连接缺损严重；中药组结肠黏膜的超微结构损伤明显缓解，线粒体的肿胀明显缓解；细胞间连接趋于正常；抑制剂组结肠黏膜的超微结构损伤较中药组明显加重，较模型组明显缓解，见图6。

图6 各组结肠组织超微结构(电镜，×20 000)  

3、讨论

胃肠疾病的病理机制十分复杂，临床上尚缺乏根治性的西医药技术[8]。我国传统医学对急、慢性胃肠疾病的研究积累了较为丰富的经验，尤其是在对由脾胃虚寒引起的腹痛、 腹胀等疾病的治疗上，取得较为满意的疗效，但是由于尚缺乏对其中分子机制的报道，限制了其推广应用，因此，从疾病的分子机制入手，深入揭示中药的作用靶点，不仅有利于新药的研发，更有助于中医药技术在学术界的推广应用。黏膜组织是肠道抵御有害物质和病原微生物入侵的第一道防线，结肠屏障主要由黏膜上皮、胞间紧密连接及固有膜层组成，其中由吸收细胞、潘氏细胞和杯状细胞组成的结肠黏膜上皮具有吸收与屏障的功能[9]。在正常生理状态下，结肠屏障不仅能阻止病原性微生物的侵袭，还能防止胃肠道内的细菌、细菌毒素、消化酶等物质的渗透。但是当机体处于脾胃虚寒等状态中时，外界刺激或内生寒邪累及脾阳，结肠黏膜受病邪所累，在启动自我防御的同时，结肠屏障的高度特异性结构随之受损，黏膜出现一定的病理损伤，杯状细胞数量锐减，黏膜屏障损伤严重，黏膜ZO-1和Claudin-1表达随之减少，肠黏膜的通透性发生改变，病原性物质进入机体及细胞内部，刺激TNF-α、IL-6等炎性因子的大量释放，TNF-α、IL-6含量升高将诱导更广泛的炎性应激，促使黏膜细胞趋于凋亡，更加重肠道损伤，促使更多的有毒物质在体内集聚，结肠黏膜细胞凋亡加剧，进一步加重肠道黏膜屏障损伤，如此成为恶性循环[10]。仲景名方黄芪建中汤以温中补虚，升阳止痛为主，广泛用于脾胃虚弱，痉挛疼痛的临床治疗中。最新的药理学研究[11]显示，黄芪建中汤能明显下调炎性应激的扩大，增强肠道细胞自我修复能力，提高机体免疫力，保护消化道黏膜组织。本研究结果证实，药物对脾胃虚寒大鼠肠道屏障的保护作用。

更深入研究药物的作用靶点可以更进一步地揭示疾病的发展历程。PPARγ在机体内的脂肪组织、免疫细胞及结肠组织等部分广泛表达，直接调控细胞的脂质代谢，参与细胞的生长、增殖、分化、衰老及凋亡等生物学过程，因其能逆转细胞中的炎性反应，在心脑血管及消化道疾病中成为潜在的治疗位点[12]。Lee等[13]研究报道，使用PPAR-γ激动剂5-氨基水杨酸处理炎症性肠病小鼠后，其肠道黏膜的线粒体功能明显改善，黏膜炎性分子的释放明显降低。Huang等[14]研究显示，在实验性结肠炎小鼠模型中，增强PPAR-γ表达能明显降低由葡聚糖硫酸钠诱导的肠上皮细胞的凋亡，降低动物血清中的炎性因子的含量。本研究结果说明，siRNA-PPARγ能逆转黄芪建中汤对实验动物结肠黏膜的保护作用。

综上，黄芪建中汤能抑制脾胃虚寒大鼠的炎性应激，抑制其细胞凋亡，保护结肠黏膜屏障。但是将黄芪建中汤应用到脾胃虚寒的临床治疗中，还要结合患者个体体质的特殊性，辅以其他中药组分，考虑合适的给药途径和剂量，减轻患者的临床症状。

参考文献:

[1]闫君,邬思芳,刘莉,等.基于尿液代谢组学比较厚朴温中汤合煎与单煎对脾胃虚寒大鼠的影响[J].中国实验方剂学杂志,2020;26(20):117-23.

[2]覃凌娜,税典奎,陈峭,等.基于红外皮温测定观察温胃阳汤对脾胃虚寒型肠上皮化生的临床疗效[J].时珍国医国药,2019;30(9):2175-7.

[3]牛源菲,温瀑,李玲玲,等.基于“病证-效应-生物样本分析”方法的炮姜温经止血功效物质及归经研究[J].中华中医药杂志,2020;35(3):432-9.

[7]宋厚盼,陈小娟,曾梅艳,等.基于Raf/MEK/ERK 信号通路探讨黄芪建中汤治疗大鼠脾胃虚寒型十二指肠溃疡的作用机制[J].中药新药与临床药理,2021;32(8):1093-100.

[11]杨阳,胡美薇,傅丽娟,等.加味黄芪建中汤通过调节miR-516a-5p治疗血小板减少症[J].中国病理生理杂志,2021;37(4):718-24.

基金资助:河北中医药管理局项目(2021366);

文章来源:王明丽,赵卫国,宋鹏程,等.黄芪建中汤通过PPARγ信号对脾胃虚寒大鼠结肠屏障的影响及机制[J].中国老年学杂志,2024,44(08):1911-1917.