川崎病是一种多见于儿童的全身性血管炎症疾病，该病主要发生在儿童早期，以高热、结膜炎、口腔黏膜炎、皮疹、淋巴结肿大等症状为特征，累及小型和中型血管，特别是冠状动脉，可能导致冠心病、心肌梗死和心肌炎等严重并发症[1]。川崎病病因仍未完全阐明，目前临床治疗方法有口服阿司匹林、静脉注射免疫球蛋白和糖皮质激素等，并且随着中医药的广泛运用，其在改善川崎病患者的症状和预防冠心病等并发症方面取得了一定的成果[2-3]。

活血化瘀法是中医学重要治法之一，可以疏通血脉、促进血行、祛除瘀血，广泛运用于川崎病的治疗中。本文通过挖掘活血化瘀法治疗川崎病的用药规律，探讨活血化瘀中药在川崎病中的配伍规律，并结合网络药理学和分子对接技术，探索其可能的分子机制和生物学效应，为后续实验及临床应用提供依据。

1、资料与方法

1.1 数据来源

检索中国知网、维普、万方、中国生物医学、Pubmed、Web of Science、Cochrane Library、Embase等数据库从建库至2023年10月的有关临床通过活血化瘀法治疗川崎病的文献，收集其中的中药复方，检索词包括但不限于“活血化瘀”“川崎病”“中医”“中药”等。

1.2 纳入标准

研究对象为具有明确诊断标准，诊断为川崎病的患者；随机对照试验；复方组成明确且疗效确切。

1.3 排除标准

复方组成不明或无具体组成；动物实验；综述、个案报道、名医经验等。

1.4 药名规范

以最新版《中国药典》和《中药学》为标准规范药物名称及性味归经等。

1.5 数据录入和处理

收集所有方剂中的药物并录入Excel 2019，数据由两人核对；统计中药使用及性味归经等的频次；高频药物的关联规则采用R studio进行分析，聚类分析采用IBM SPSS Statistics 25.0。

1.6 网络药理学分析

1.6.1 有效化合物和靶点整理

以各核心药对中药为检索词在中药系统药理分析平台（TCMSP）搜索化合物成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18作为筛选条件，筛选出中药的活性成分。之后通过SwissTarget Prediction、STITCH等数据库预测其作用的靶点。以“kawasaki disease”为检索词分别在GeneCards和OMIO中获取川崎病的靶点，之后将两组数据合并并删除重复项得到川崎病靶点。于Venny 2.1.0中绘制活性成分与川崎病靶点的交集图，获得交集靶点。

1.6.2 中药-活性成分-交集靶点网络图和PPI图构建

将筛选出的化合物及其治疗川崎病预测的靶点导入软件Cytoscape 3.9.1中绘制“中药-活性成分-交集靶点”网络图。利用Network Analyzer插件计算网络节点度值（degree），筛选出发挥关键作用的活性成分。在STRING数据库中输入交集靶点，以“Homo sapiens”搜索，设置蛋白相互作用阈值为0.9，之后进行蛋白互作PPI网络分析，将分析所得的数据导入Cytoscape 3.9.1软件，计算节点度值，根据度值大小筛选PPI网络中核心的效应靶点并进行可视化。

1.6.3 GO和KEGG富集分析

在David数据库中导入关键靶点，之后进行GO富集和KEGG通路富集分析。阈值设置为P<0.05，选取排名前10的GO条目及前20的通路用R 4.1.2clusterProfiler、ggplot2、enrichplot等进行可视化。

1.6.4 分子对接

于PDB数据库下载靶点的3D结构，去掉小分子配体。在TCMSP平台中获取活性成分的2D结构。经Autodock软件处理后获取PDBQT文件，进行分子对接。对接结果用Pymol进行可视化。

2、结果

2.1 文献与中药数据情况

初步检索到319篇文献，根据筛选标准，最终有41篇文献被纳入，得到48首有效中药处方，涉及96味中药。

2.2 中药频次分析

见表1。48首处方涉及96味中药，用药总频次426次。其中，有12味药物的用药频次≥15次。用药频次排名前10位的中药依次是地黄、连翘、赤芍、石膏、水牛角、玄参、麦冬、丹参、淡竹叶和金银花。

表1 前10味高频药物频数统计表

2.3 五味归经分析

见图1。对96味中药进行五味归经分析。结果显示，药味以甘（40次，35.08%）和苦（35次，30.70%）为主；归经以肺经（36次，19.25%）和肝经（30次，16.04%）居多。

图1 中药五味归经统计

2.4 高频药物的关联规则分析

见表2、图2。使用关联性规则分析，对20味高频中药进行配对，设置支持度≥1.00，置信度≥0.25，且提升度≥1.50等条件，得到关联较高的药物配伍，筛选结果见表2，绘制出关联规则网状图，见图2。

2.5 高频药物的聚类分析

采用IBM SPSS Statistics25.0软件对用药频次前20的中药进行系统聚类分析。采用组间联接聚类方法分析，药物分为3类（见图3）。分别为：①红花、桃仁、当归、麦冬、五味子、赤芍、丹参；②玄参、黄连、石膏、知母、水牛角、牡丹皮、地黄、连翘、淡竹叶、金银花；③甘草、黄芩、栀子。

2.6 药物-有效成分-靶点网络图和PPI图构建

将玄参、地黄、连翘、淡竹叶、金银花和牡丹皮作为核心药组，在TCMSP中最终得到活性化合物36个，预测靶点192个，筛选出川崎病靶点共759个。为进行下一步研究，将以上靶点标准化，统一转换为Gene ID。通过Venny图分析得到核心药组与疾病靶点的交集靶点共有82个，见图4。将以上交集的82个靶点，运用Cytoscape 3.7.2绘制出中药-活性成分-交集靶点网络图，该网络中共有123个节点，481条边，见图5，其中，圆形代表核心药对的中药，八边形代表化学成分，菱形代表靶点，V形代表药材的共有化合物，共有化合物如表3所示。根据网络节点度值大小，发挥关键作用的活性成分依次为Quercetin（槲皮素）、Kaempferol（山奈酚）、Luteolin（木犀草素）、Wogonin（汉黄芩素）和betacarotene(β-胡萝卜素）。

交集靶点导入STRING数据库生成PPI网络图，据度值大小筛选出排名前10的核心靶点，依次为TNF、AKT1、RELA、MAPK14、CTNNB1、IL-6、TP53、ESR1、MAPK1和EGFR，可视化见图6。

表2 中药配伍表前15项

图2 关联规则网状图

2.7 GO和KEGG富集分析

GO和KEGG通路富集分析结果见图7、图8。通过GO功能富集分析共得到1 676个GO条目（P<0.05），其中有1 489个生物过程（BP）条目，涉及positive regulation of cell migration（细胞迁移的正向调节）、positive regulation of cell motility（细胞运动的正向调节）、response to inorganic substance（对无机物质的响应）、response to reactiveoxygenspecies（对活性氧的反应）等方面；76个细胞组成（CC）条目，涉及plasmamembrane raft（质膜筏）、membrane raft（膜筏）、vesicle lumen（囊腔）、membrane microdomain（膜微区）等方面；111个分子功能（MF）条目，涉及cytokine receptor binding（细胞因子受体结合）、signaling receptor activator activity（信号受体激活活性）、cytokine activity（细胞因子活性）、kinase regulator activity（激酶调节活性）等方面。KEGG通路富集分析显示涉及的通路主要有fluid shear stress and atherosclerosis（流体剪切应力和动脉粥样硬化）、pathways in cancer（癌症通路）、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications（糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路）、lipid and atherosclerosis（脂质与动脉粥样硬化）和proteoglycans in cance(r癌症中的蛋白聚糖）等。

图3 高频药物聚类分析图

图4 交集靶点韦恩图

表3 共有化合物及编号表

图5 中药-活性成分-交集靶点网络图

图6 蛋白-蛋白互作网络图

图7 GO富集分析

图8 KEGG富集分析

2.8 分子对接

将核心化合物Quercetin（槲皮素）、Kaempferol（山奈酚）、Luteolin（木犀草素）、Wogonin（汉黄芩素）和beta-carotene(β-胡萝卜素）与核心靶点TNF、AKT1、RELA和MAPK14对接，结果见图9。通常认为，对接结果≤-5 kJ/mol表明蛋白与小分子之间存在较好的结合活性。据图9中数据可知，最低结合能均≤-5 kJ/mol，提示它们之间能够较好结合。选取最低结合能排名前2的对接结果于Pymol中进行可视化，对接模式结果如图10所示。

图9 分子对接结果

图1 0 分子对接可视化图

3、讨论

川崎病可能引发一系列复杂的心血管并发症，如冠状动脉炎、心脏瓣膜损害和血管炎症等。川崎病确切的发病机制至今尚未完全明晰，遗传、感染、免疫异常等因素与该病的发生有关[1,3]。过往研究发现在本病的中药治疗上，多选用清热、补阴、活血化瘀等中药，治法以清热泻火、养阴生津、活血化瘀为主[4]。现代研究表明活血化瘀类中药在治疗川崎病方面具有较好的效果，可以促进血液循环、减轻炎症反应，并具有一定的抗血小板聚集和抗凝血活性[5]。尽管临床研究指出活血化瘀类中药在川崎病治疗中显示出一定疗效，然而，该类药物的确切机制和用药特点仍未被充分阐释[6]。

数据挖掘能通过关联规则分析、因子分析和聚类分析等总结用药规律，预测核心药物防治脑缺血再灌注损伤的潜在作用机制[7-8]。本研究利用数据挖掘、网络药理学以及分子对接技术，对活血化瘀法在治疗川崎病中的作用机制进行了深入探究和分析。研究结果显示，活血化瘀类方剂的常用药物包括地黄、连翘、赤芍、石膏、水牛角、玄参、麦冬、丹参、淡竹叶和金银花等。其中药味以甘和苦为主，归经以肺经和肝经为主。中医理论认为，苦味药物具有降泄作用，而甘味药物则有缓和作用。活血化瘀类药物的成分能够促进血液循环，消散瘀血。苦味药物具有泄泻、干燥、坚固等特性，通过其降泄作用，赋予活血药物解瘀、促进血行的能力，使瘀血多从下行；甘味药物则具有补益、和缓的作用，通过缓和活血药物的药性，使其作用不过于强烈，其活血的功效常常通过结合四气或其他药物特性来实现，故苦味和甘味药物常联合使用[9-10]。聚类分析得到3组核心药物，分别为第1组红花、桃仁、当归、麦冬、五味子、赤芍、丹参；第2组玄参、黄连、石膏、知母、水牛角、牡丹皮、地黄、连翘、淡竹叶、金银花；第3组甘草、黄芩、栀子。上述药味中以活血药为主，其中根据频数分析和关联规则分析，本研究确定玄参、地黄、连翘、淡竹叶、金银花和牡丹皮作为核心药组。玄参是常用的活血化瘀药，既能清热凉血，养阴护卫，又能滋阴降火、润燥滑肠，具有抗炎、抗氧化和抗凝血作用[11]。地黄味甘，具有补肝肾、滋阴润燥、清热解毒的功效，常用于疲乏无力、腰膝酸软、头晕耳鸣等症状。现代研究发现地黄含有苯乙醇苷类、环烯醚萜苷类、糖类、氨基酸等多种生物活性成分，具有抑菌、抗肿瘤、降血糖等作用[12-13]。连翘与金银花具有抗菌、抗病毒作用[14-15]。牡丹皮具有清热凉血、活血化瘀作用[16]。

对核心组方的5味中药进行网络药理学分析，最终收集到36个活性化合物，其治疗川崎病的靶点共82个。其中核心化合物分别为槲皮素、山奈酚、木犀草素、汉黄芩素和β-胡萝卜素。大量基础研究表明，各种细胞因子在川崎病的发生发展中发挥重要的作用，如白细胞介素[17]和肿瘤坏死因子[18]等。研究表明槲皮素、山柰酚和木犀草素能够下调TNF、IL-6、IL-1β等细胞因子的表达及分泌[19]。本研究通过构建PPI网络，筛选得出核心靶点为TNF、AKT1、RELA、MAPK14、CTNNB1、IL-6、TP53、ESR1、MAPK1和EGFR，这些化合物和靶点可能是活血化瘀药治疗川崎病的关键因子。研究表明，急性期川崎病的TNF-α表达上升，通过TNFRI通路转导TNF-α介导的功能，导致冠状动脉炎症的发展[20-21]。内皮细胞中AKT1磷酸化的p21可以促进血管生成和转移，提示p21磷酸化可能在川崎病冠状动脉损伤中发挥重要作用[22]。RELA即p65，研究表明抑制p65的表达能够减轻川崎病血管模型心肌组织的炎症损伤和细胞焦亡[23]。

GO富集分析显示，活血化瘀核心药组治疗川崎病主要集中在细胞迁移的正向调节、细胞运动的正向调节、对无机物质的响应、对活性氧的反应等生物学过程，定位在膜筏、膜微区、质膜筏、囊腔等部位，影响细胞因子受体结合、信号受体激活活性、激酶调节活性、细胞因子活性等的生命活动。KEGG富集分析显示，fluid shear stress and atherosclerosis（流体剪切应力和动脉粥样硬化）、Pathways in cancer（癌症通路）、AGE-RAGEsignalingpathwayindiabetic complications（糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路）、Lipid and atherosclerosis（脂质与动脉粥样硬化）和Proteoglycans in cancer（癌症中的蛋白聚糖）等相关通路较为重要。这些通路可能是活血化瘀方治疗川崎病主要的作用途径。川崎病患者在发病后可能存在心血管问题，包括冠状动脉炎、动脉瘤形成等，这些心血管并发症与动脉粥样硬化的发展有关。川崎病引起的血管壁损伤和炎症反应可能导致血管内膜的异常变化，为动脉粥样硬化的形成提供了基础，活血化瘀核心组方可能通过各种影响动脉粥样硬化形成的通路，减轻血管炎性反应等，提高患者治愈率及改善预后[24-25]。

分子对接结果表明，核心化合物槲皮素、山奈酚、木犀草素、汉黄芩素和β-胡萝卜素与核心靶点TNF、AKT1、RELA、MAPK14之间能够较好结合，提示这些核心靶点在川崎病的治疗中发挥着关键的作用。

综上，本研究充分发挥了数据挖掘、网络药理学和分子对接各自的优势，初步探讨了活血化瘀类中药治疗川崎病的组方规律和作用机制，这为进一步进行实验验证等工作提供了方向。

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基金资助:广东省中医药局科研项目(20212060);

文章来源:区秀汝,麦绮琪,陈正义,等.活血化瘀法治疗川崎病用药规律挖掘及起效机制研究[J].新中医,2024,56(21):1-9.