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α-硫辛酸对动脉粥样硬化兔炎症因子SIRT1/NF-κB信号通路影响

2024-11-12 15 上传者：管理员

摘要：目的观察α-硫辛酸(LA)对动脉粥样硬化(AS)兔炎症因子和沉默信息调节因子(SIRT)1/核因子(NF)-κB信号通路的影响，探讨LA防治AS的作用机制。方法采用数字表法将30只家兔随机分为对照组、模型组与LA组各10只。使用免疫反应损伤和高脂饲养的方法构建AS兔模型，建模成功后，LA组予以50 mg/kg LA腹腔注射，连续干预14 d,对照组与模型组予以等量生理盐水注射。检测各组血清血脂水平，使用酶联免疫吸附试验检测各组血清白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β水平，苏木素-伊红(HE)染色观察主动脉弓组织形态改变，并使用Western印迹法检测各组胸主动脉SIRT1、NF-κB蛋白表达。结果相比对照组，模型组、LA组血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、IL-6、TNF-α、IL-1β水平均显著上升(P<0.05);与模型组对比，LA组血清TC、TG、LDL-C、IL-6、TNF-α、IL-1β均显著下降(P<0.05)。HE染色结果显示，LA组主动脉弓组织结构较模型组清晰，平滑肌细胞较模型组整齐，存在轻度脂质沉着，可见少许泡沫细胞。相比对照组，模型组、LA组胸主动脉SIRT1表达显著下降，NF-κB表达显著上升(P<0.05);与模型组对比，LA组胸主动脉SIRT1表达显著上升，NF-κB表达显著下降(P<0.05)。结论 LA对AS兔有治疗作用，能够改善血脂，减轻炎症反应，其机制可能与调控SIRT1/NF-κB信号通路有关。

关键词：
α-硫辛酸
动脉粥样硬化
核因子(NF)-κB
沉默信息调节因子1
炎症反应
血脂
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动脉粥样硬化(AS)是一种慢性炎症性血管病变，是心血管疾病的重要发病基础[1]。近年来，尽管AS的病理生理机制取得较大突破，但其防控仍不乐观，AS性心血管疾病是我国居民的首要威胁[2]。AS的发病机制尚未完全阐明，涉及脂质积聚、炎症和氧化应激等多个方面，其中炎症反应被认为是AS发生发展的核心环节，贯穿AS病变的整个过程[3]。沉默信息调节因子(SIRT)1在调节炎症、影响细胞自噬等过程中有着重要作用，并对延缓AS进程有积极作用[4]。SIRT1能够抑制核因子(NF)-κB激活引起的炎症反应，增强AS斑块的稳定性[5]。由此推测，SIRT1/NF-κB通路可能为AS治疗的潜在靶点。

α-硫辛酸(LA)是一种强效的抗氧化剂，具有清除氧自由基、抗炎等药理作用，其能够清除机体活性氧(ROS),下调NF-κB蛋白表达，降低机体炎症水平[6]。既往研究发现，LA通过抗氧化、上调自噬水平等机制改善微血管病变[7],临床上，其对糖尿病合并AS患者血脂有明显调节作用[8],但其对AS的作用机制研究尚缺乏。基于此，本课题构建AS兔模型，观察LA对AS的干预效果，并探讨SIRT1/NF-κB通路介导LA防治AS的机制，为LA治疗AS提供理论依据。

1、材料与方法

1.1实验动物

SPF级雄性家兔30只，体质量1 500～2 000 g,购于北京维通利化实验动物中心，在实验前，家兔适应性饲养1 w,室温(22±2)℃,湿度为50%～70%,12 h昼夜交替，自由饮食饮水。本研究经南通大学附属医院动物伦理委员会审查批准。

1.2试剂和仪器

高脂饲料(15%蛋黄粉+1%胆固醇+5%猪油+79%标准兔饲料),牛血清蛋白(上海源叶生物科技有限公司),卵清白蛋白(美国Sigma公司),总胆固醇(TC)检测试剂盒、三酰甘油(TG)检测试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所产品),戊巴比妥钠(北京化学试剂公司),苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(自云南淘谜生物科技有限公司),SIRT1一抗、NF-κB一抗(西安迪诺生物科技有限公司),白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α检测试剂盒、IL-1β(武汉云克隆);电泳仪(美国Bio-Rad),切片机(德国Leica),显微镜(日本Olympus公司),离心机(德国Eppendorf)。

1.3建模及分组

采用数字表法将30只家兔随机分为对照组、模型组与LA组各10只。对照组予以标准饲料饲养，其余两组参照文献[9]方法构建AS兔模型，使用高脂饲料饲养，经耳缘予以牛血清白蛋白注射(剂量为25 mg/kg),每3 d进行1次，连续3次，并予以卵清白蛋白注射(剂量为2.5 mg/kg),每2 d进行1次，连续2次，饲养8 w后，造模两组均随机抽取2只兔来验证造模，采血进行血脂检测，观察主动脉弓部组织病理改变，若血脂增高，主动脉内膜增厚，泡沫细胞大量聚集，平滑肌细胞增多且排列紊乱，说明AS兔模型构建成功。建模成功后1 d, LA组予以LA腹腔注射，剂量为50 mg/kg,每天1次，连续干预14 d。对照组、模型组则予以等量生理盐水注射。

1.4血脂水平检测

干预结束后次日，经耳缘静脉采血4 ml,离心(转速3 000 r/min,半径8.5 cm)处理10 min,分离得到血清，置于-20℃下保存。使用酶联免疫吸附试验对TC、TG、LDL-C水平进行测定。

1.5血清炎症因子检测

同1.4中方法采集兔静脉血，分离血清，对血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平进行检测，使用酶联免疫吸附试验进行测定。

1.6 HE染色观察兔主动脉弓组织形态改变

取血后，使用3%戊巴比妥钠经耳缘静脉注射麻醉，剖开腹腔，将主动脉根部分离，游离至髂动脉分叉处血管，生理盐水冲洗后，将主动脉弓部组织取出，纵向剪开摊平，生理盐水清洗后，予以石蜡包埋，经切片后，实施HE染色，显微镜下对主动脉弓部组织病理形态进行观察。

1.7 Western印迹法检测兔胸主动脉组织SIRT1、NF-κB蛋白表达

剖取出兔胸主动脉组织，并将组织置于EP管中，-80℃下冻存。取胸主动脉组织约0.3 g,经放射免疫沉淀(RIPA)缓冲液溶解，提取蛋白。行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后转膜封闭。分别加入SIRT1抗体、NF-κB抗体、β-actin抗体(1∶1 000),4℃过夜，然后将膜与过氧化氢酶耦联的二抗室温下孵育2 h,检测IL-10、β-EP蛋白含量。

1.8统计学处理

采用SPSS24.0软件行单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。

2、结果

2.1各组血脂水平比较

各组血脂水平有统计学差异(P<0.05)。相比对照组，模型组、LA组血清TC、TG、LDL-C均显著上升(P<0.05);与模型组对比，LA组血清TC、TG、LDL-C均显著下降(P<0.05)。见表1。

2.2各组家兔血清炎症因子比较

各组血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平有统计学差异(P<0.05)。相比对照组，模型组、LA组血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平均显著上升(P<0.05);与模型组对比，LA组血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平均显著下降(P<0.05)。见表1。

表1各组血脂水平、血清炎症因子、胸主动脉SIRT1、NF-κB蛋白表达比较

2.3各组胸主动脉SIRT1、NF-κB蛋白表达水平比较

各组SIRT1、NF-κB蛋白表达有统计学差异(P<0.05)。相比对照组，模型组、LA组胸主动脉SIRT1表达显著下降，NF-κB表达显著上升(P<0.05);与模型组对比，LA组胸主动脉SIRT1显著上升，NF-κB表达显著下降(P<0.05)。见表1、图1。

2.4各组主动脉弓组织病理形态比较

对照组主动脉弓部未见明显病变，组织结构正常、界限清楚，无脂质沉着；模型组主动脉弓组织界面模糊，平滑细胞增多，脂质浸润明显，并可见泡沫细胞聚集；LA组主动脉弓组织结构相比模型组较清晰，平滑肌细胞较模型组整齐，存在轻度脂质沉着，可见少许泡沫细胞。见图2。

图1各组胸主动脉SIRT1、NF-κB蛋白表达

图2各组主动脉弓组织病理形态(HE染色，×200)

3、讨论

AS是常见的老年性疾病，是老年人脑梗死和心肌梗死的重要诱因，故研究AS的病理机制，探寻有效的防治手段意义重大。LA是一种天然抗氧化剂，有着强效抗氧化能力，在临床上多用于糖尿病并发症的治疗[10]。研究发现，LA对动脉血管内皮损伤有保护作用，能够有效防治AS斑块[11]。研究提示，LA能够改善AS病理改变，延缓AS的进程[12]。本研究证明，LA对AS有防治作用。脂质代谢异常是AS发生发展的关键因素。脂质代谢紊乱可使得血管壁脂质堆积，诱导斑块形成，与AS发生密切关联[13]。血脂水平尤其是LDL-C水平越高，患者AS程度越严重[14]。本研究表明，LA能够改善AS兔血脂水平。先前研究表明，LA能够改善非酒精性脂肪肝大鼠脂质代谢[15],这与本研究类似。

炎症反应在AS发生发展中有着重要作用，炎症因子表达增高可引起血管内皮细胞损伤，诱导血栓和斑块形成，参与AS发病[16]。IL-6、IL-1β是常见的促炎因子，能够促进炎症细胞聚集，其诱导的炎症反应贯穿于AS病变全过程[17]。TNF-α是反映机体炎症程度的重要指标，其表达增高会加剧炎症反应，促使不稳定斑块破裂，被认为是AS治疗的重要靶点[18]。以上分析提示，抑制炎症反应在AS治疗中尤为关键。本研究提示，LA能够减轻AS兔炎症反应，进而达到防治AS的作用。SIRT1/NF-κB信号通路是介导AS形成过程的重要信号通路，在炎症反应过程中起着调节作用[19]。其中NF-κB是炎症反应的重要转录因子，能够调控炎症因子的表达，与AS形成密切关联[20]。NF-κB蛋白活化后，进入细胞核，可启动IL-6、TNF-α等炎症因子的转录。SIRT1作为一种去乙酰化酶，可通过介导NF-κB的去乙酰化，产生抗氧化、抗炎等作用[21]。下调SIRT1表达可增强AS过程中的炎症反应，而上调SIRT1表达能够引起NF-κB的抑制，阻断促炎因子的释放，缓解炎症反应，从而改善AS病理状态[22,23]。研究表明，LA能够抑制NF-κB的激活，减轻大鼠炎症反应[24]。本研究提示，LA能够调控SIRT1/NF-κB信号通路，推测这可能是其减轻炎症及防治AS的重要机制。

综上，LA能够纠正AS兔脂质代谢异常，减轻炎症，改善AS病理状况，其机制可能与上调SIRT1蛋白表达、抑制NF-κB信号激活有关。本研究为LA用于AS的防治提供了一定理论依据，但LA能否通过介导其他信号通路来治疗AS,仍有待研究。

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