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ADAMTS13抑制动脉粥样硬化模型小鼠血管炎症

2024-08-23 6 上传者：管理员

摘要：目的观察血管性血友病因子（vWF）裂解酶（ADAMTS13）在动脉粥样硬化慢性炎症环境中的作用。方法载脂蛋白E缺乏(ApoE-/-)和ADAMTS13-/-ApoE-/-小鼠用高脂肪的西方饮食喂养12 w。心脏冰冻切片采用苏木素-伊红染色，主动脉根部动脉粥样硬化病变进行组织学检查。ApoE-/-和ADAMTS13-/-ApoE-/-小鼠主动脉组织切片免疫组织化学染色后观察巨噬细胞浸润数量。利用活体镜检法观察提睾肌静脉氧化损伤、白细胞移动和黏附。结果 ADAMTS13-/-ApoE-/-小鼠主动脉表面及主动脉根部的动脉粥样硬化程度较ApoE-/-小鼠明显严重，ADAMTS13-/-ApoE-/-小鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块形成的范围增加约6.1倍（P<0.05）。与ApoE-/-小鼠比较，ADAMTS13-/-ApoE-/-小鼠白细胞移动速度显著减慢（P<0.001）,白细胞滚动数量显著增加（P<0.01）,同时伴有巨噬细胞浸润。结论 ADAMTS13基因缺陷的动脉粥样硬化小鼠模型在实验中血管炎症反应更加明显，ADAMTS13在动脉粥样硬化的慢性炎症环境中对血管炎症有抑制作用。

关键词：
vWF
动物模型
动脉粥样硬化
炎症反应
血管性血友病因子裂解酶
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血管性血友病因子(vWF)裂解酶(ADAMTS13)是一种含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶家族第13位成员[1]。目前vWF是ADAMTS13已知的唯一生理底物[2],因此在生理上ADAMTS13作为把控者调节着血管中可导致血栓形成的UL-vWF多聚体的数量[3,4]。有研究表明，vWF及其调节剂ADAMTS13除了参与止血之外，还可以参与血管炎症和免疫相关血栓的形成机制，如白细胞滚动粘连和外渗[5],而ADAMTS13和vWF在血栓形成和全身炎症反应过程中起着相反的作用[6]。vWF与ADAMTS13在动脉粥样硬化的发病机制中，通过募集巨噬细胞和嗜中性粒细胞促进炎症斑块的形成及炎症发展[7],vWF和ADAMTS13甚至可以作为心血管、代谢和炎性疾病(如糖尿病、脑卒中、心肌梗死和脓毒症)的预后生物标志物[5]。

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，是血管壁对各种原因损伤作出的一种异常反应，具有经典炎症变性、渗出及增生的特点[8]。动脉粥样硬化始于剪切力紊乱引起的内皮功能失调，功能失调的内皮呈现活化状态。单核细胞黏附在活化的内皮上，继而分化为促炎性巨噬细胞，促炎性巨噬细胞可增加对氧化低密度脂蛋白 (ox-LDL)的摄取变成泡沫细胞，增强炎症信号的传递[9]。有多种因素会加速动脉粥样硬化的过程，例如炎症趋化因子和细胞因子的释放，活性氧(ROS)的生成、生长因子及血管平滑肌细胞的增殖，而炎症和免疫是动脉粥样硬化发展和导致并发症的关键因素[9]。现有的动物模型实验和临床研究结果表明，拮抗vWF可有效抗炎和抗血栓形成[10]。目前已有很多关于ADAMTS13与vWF在急性炎症反应中的作用研究，本文旨在研究ADAMTS13在动脉粥样硬化的慢性炎症环境中对血管炎性的作用。通过构建ADAMTS13基因缺陷的动脉粥样硬化小鼠模型，对比观察ADAMTS13基因缺陷小鼠在血管炎症反应中的差异。

1、材料与方法

1.1 主要试剂与器材

组织冰冻包埋剂(特德佩拉公司，美国)、罗丹明6G(Sigma, 美国)、抗生物素蛋白-生物素封闭溶液(载体，伯林盖姆，美国)、1∶100 鼠抗鼠 CD107b 抗体(Mac3,BD Pargmigen, San Jose, CA)、免疫印迹抗鼠免疫球蛋白抗体(ImmPRESS)抗鼠 IgG 抗体(载体实验室，美国)、封片剂(飞世尔科技公司，美国)、Nikon ECLIPSE-80i显微镜配有尼康数码相机(尼康股份有限公司，美国)、倒置荧光显微镜：配有高速数字相机(奥林匹克运动会，中心谷，PA)、NIS 原理图像分析系统、NIS Elements原理软件、尼康80i数码荧光显微镜(尼康股份有限公司，美国)、GraphPad软件(拉荷亚，美国)、奥德赛成像系统(LICOR)、解剖显微镜、光学显微镜、低温恒温箱、低温冰箱、ImageJ 软件、NIH ImageJ 软件。由21.2%脂肪和0.2%胆固醇组成的高脂肪的西方饮食(哈伦实验室，美国)。

1.2 实验动物

载脂蛋白E缺乏(ApoE-/-)小鼠(C57BL/6J品系)从杰克逊实验室购买(Bar Harbor, ME)、ADAMTS13-/-小鼠(C57BL/6/129品系)由David Ginsburg博士友情提供。

1.3 动物模型建立

ApoE-/-小鼠和ADAMTS13-/-小鼠繁殖超过4代可以产出ADAMTS13-/-ApoE-/-小鼠。当小鼠达到6 w龄时，开始予以高脂肪的西方饮食喂养，共喂养12 w。

1.4 组织学检查主动脉根部的动脉粥样硬化病变

ApoE-/-小鼠和ADAMTS13-/-ApoE-/-小鼠在12 w高脂肪饮食后被安乐死。用10%中性甲醛缓冲液固定心脏过夜，并且嵌入组织冰冻包埋剂。用低温恒温箱将心脏切片(6 μm, 间隔80 μm)。在延边大学的组织学实验室，将每个心脏分别取12个组织切片，放置在载玻片上，进行苏木素-伊红染色。使用Nikon ECLIPSE-80i显微镜配有尼康数码相机DXM1200得到每个切片的数字图像。整个主动脉根部动脉粥样硬化斑块形成区域切片后，用ImageJ软件在双盲的条件下进行分析。

1.5 白细胞移动与移动速度

向小鼠腹腔内注射戊巴比妥钠使其麻醉。将提睪肌血管剥离后，局部予以2.5%FeCl3浸泡过的滤纸覆盖10 s使其损伤。将罗丹明6G[1 μg/g体质量用100 μl磷酸盐缓冲液(PBS)稀释]通过逆行注入眶窦丛来标记白细胞和血小板。用配有高速数字相机的倒置荧光显微镜(×100)实时记录向受损血管周围移动的白细胞。影像都通过来自尼康股份有限公司的NIS Elements原理软件记录。(影像Ⅰ和Ⅱ仅在线数据补充)白细胞移动的数量和速度(μm/s)使用NIS原理图像分析系统脱机处理后得到。实验分为ApoE-/-组和ADAMTS13-/-ApoE-/-组，每组6只小鼠，每只分别在损伤血管处取6个不同点记录白细胞滚动的数量。移动速度取决于方程式：V=100 μm的固定距离/移动所需要的时间(s),V代表速度(μm/s)。根据不同速度函数的累积频率，应用GraphPad软件制作得到的曲线与S形曲线相符。

1.6 巨噬细胞的免疫组织化学染色

向组织嵌入制冷剂后，用甲醛溶液固定恒温箱切片后的主动脉组织(6 μm)。组织切片使用PBS冲洗，后放入高压锅中用0.1 mol/L柠檬酸盐(pH6.0)处理5 min, 使其恢复抗原性。冰冻切片用抗生物素蛋白-生物素封闭溶液封闭后，加入鼠抗鼠CD107b抗体(Mac3,1∶100)后于4 ℃恒温箱中过夜。然后加入Imm PRESS 抗鼠IgG抗体(载体)。冰冻切片组织用苏木素复染，然后用封片剂封片。数字图像应用尼康80i数码荧光显微镜获得。

1.7 统计学分析

采用Prism5 GraphPad软件行单因素方差分析，组间连续性差异采用双尾t检验。

2、结果

2.1 主动脉根部粥样硬化病变组织学检查

ADAMTS13-/-ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化程度比ApoE-/-小鼠明显严重(9.77±2.81 vs 1.64±1.46,t=6.290、P<0.05),ADAMTS13-/-ApoE-/-小鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块形成的范围增加约6.1倍。见图1。

图1 主动脉根部粥样硬化病变组织学(HE染色，×200)

2.2 主动脉弓处巨噬细胞测定

ADAMTS13-/-ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞(Mac-3 阳性)浸润的数量增多。见图2。

图2 主动脉弓处巨噬细胞(免疫过氧化物酶染色)

褐变(箭头)表明Mac-3阳性巨噬细胞

2.3 白细胞滚动、黏附

ApoE-/-和ADAMTS13-/-ApoE-/-小鼠黏附白细胞剪影见图3。白细胞滚动和黏附在ADAMTS13-/-ApoE-/-小鼠损伤血管中的数量较ApoE-/-小鼠显著增加[(44.1±1.5) vs (24.7±0.8)个，P<0.01]。同时，同样血管中白细胞移动速度在ADAMTS13-/-ApoE-/-小鼠中显著减慢[(43.83±1.47) vs (23.17±1.72)μm/s,P<0.01]。

图3 提睾肌小静脉氧化损伤后白细胞滚动及黏附

3、讨论

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，从发病到并发症的出现都涉及了炎症。已有的临床研究明确表明，炎症的调节可以预先阻止动脉粥样硬化的临床并发症[11]。动脉粥样硬化发生及发展与多种因素有关，如增加的氧化应激、炎症和低于正常水平的高密度脂蛋白、ADAMTS13活性或水平降低[12～14]。经过多种因素作用于血管壁，致使血管壁发生慢性炎症，最终形成动脉粥样硬化。

vWF除了在止血及凝血中发挥作用外，还是一种血管炎症介质。已有研究发现vWF及其调节剂ADAMTS13参与了血管炎症和免疫血栓形成的机制，如白细胞滚动、黏附和外渗、血管通透性、缺血/再灌注损伤、补充激活[10]。血小板通过刺激和分泌促炎细胞因子及促进白细胞募集、束缚和沿着活化的内皮滚动来使动脉粥样硬化持续存在[15],vWF也可以通过在结合血小板后直接或间接促进白细胞募集到发炎组织来促进炎症过程。而血小板本身可促进斑块活化，特别是通过血管炎性活化、氧化能力和炎性复合物的直接激活机制[16,17],以上均可促进动脉粥样硬化疾病的进展。血管内皮上vWF的累积一部分原因是ADAMTS13的裂解受损[18]。vWF/ADAMTS13轴与动脉粥样硬化的发病机制有关，通过炎症病变中的巨噬细胞和中性粒细胞募集促进斑块形成和炎症[15]。在不稳定型心绞痛患者中，ADAMTS13水平低于稳定型心绞痛，并显示ADAMTS13与vWF呈负相关[5]。

本实验成功建立了动脉粥样硬化小鼠模型。图像分析证明了ADAMTS13金属蛋白酶在遗传易感性小鼠免于形成早期动脉粥样硬化斑块中起着至关重要的作用。在血浆ADAMTS13活性缺乏小鼠中，可以发现P-选择素和血浆vWF水平的增加，UL-vWF多聚体受组胺(棒杆状小体促分泌素)刺激后，减慢白细胞滚动速度，但是没有减慢野生型小鼠白细胞移动速度。此外，ADAMTS13不足导致中性粒细胞溢出增多。活体显微镜在ADAMTS13-/-小鼠激活的微静脉中发现自发血栓形成；向野生型小鼠体内灌注ADAMTS13抗体延长血小板黏附在内皮的时间，诱导活化微静脉血栓形成；向活体内注射重组ADAMTS13,可以迅速消除与内皮细胞结合的vWF多聚体，并可以降低组胺激活小静脉血小板黏附和聚集，防止血栓在激活微血管形成，促进损伤小动脉血栓溶解[19]。证明ADAMTS13有强大的自然抗血栓形成的活性，通过ADAMTS13建立了炎症和血栓之间的联系，重组ADAMTS13可以作为抗凝剂用于治疗血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和由于其他的遗传缺陷、炎症性疾病、败血症等导致的血栓性疾病。基于以上研究，本文假设血浆中ADAMTS13活性缺乏会导致内皮细胞表面和血浆中UL-vWF多聚体的累积，同时也增加了血小板的黏附、聚集、血栓形成和全身炎症反应。在ApoE-/-小鼠中应用血小板黏附抑制剂(Pop/B)抑制vWF与血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰbα的结合并且防止活体内血小板黏附。长期阻断血小板黏附，导致白细胞在动脉内膜极度减少，颈动脉分叉处、主动脉窦、冠状动脉动脉粥样硬化形成减少。血小板黏附时连接GPIb-Ⅸ-Ⅴ复合体可能导致血小板整合素GPⅡb-Ⅲa激活和血小板抗剪切力沉积。随后由外向内的信号传导使细胞质Ca+含量增加，导致颗粒分泌和黏附在血小板周围强效炎症介质释放。vWF和血小板在促进全身及局部炎症反应和动脉粥样硬化病变发生和发展中发挥作用[15～17]。本文与此相符的是，在损伤血管中白细胞移动数量增加了约2倍，并且移动的速度明显降低，导致动脉粥样硬化病变中巨噬细胞浸润增加。ADAMTS13-/-小鼠全身炎症反应的增强，表现vWF的白细胞移动、黏附、溢出增加。本研究结果显示，ADAMTS13金属蛋白酶在减弱全身炎症反应中起着关键作用。早期在损伤血管处白细胞的移动、黏附和溢出的增加，可能与全身及局部炎症反应的增加有关，表明ADAMTS13可减弱全身炎症反应。

ADAMTS13在肿瘤的发生及发展、炎症和弥散性血管内凝血的病理生理过程中起一定作用，因此近年来有许多致力于ADAMTS13蛋白酶结构和功能关系的研究[20]。有研究发现，任何干扰ADAMTS13裂解内皮vWF的疾病(如高氧化应激、脂质紊乱、炎症、感染)都可能会加速动脉粥样硬化的形成，而任何增强ADAMTS13活性或抑制vWF-GPIbα相互作用的治疗都可能减慢动脉粥样硬化的形成[21]。这与本文假设的在动脉粥样硬化的慢性炎症环境中，ADAMTS13对动脉粥样硬化血管炎症有抑制作用相符合。

综上，ADAMTS13在动脉粥样硬化的慢性炎症环境中，对动脉粥样硬化血管炎症反应有抑制作用。ADAMTS13可能是通过蛋白酶切超大分子vWF多聚体抑制炎症反应。

参考文献:

20 吴昊,李华,金圣宇,等.血管性血友病因子裂解酶CysR结构域生物学功能的研究[J].中国实验血液学杂志,2021;29(3):893-900.

基金资助:国家自然科学基金(81660026,82060032); 吉林省教育厅“十三五”科学技术研究项目(吉教科合字[2016]273); 吉林省自然科学基金面上项目(YDZJ202201ZYTS222);

文章来源:王萌,赵艺鸿,金圣宇.ADAMTS13抑制动脉粥样硬化模型小鼠血管炎症[J].中国老年学杂志,2024,44(16):3933-3937.