首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 儿科论文 > 儿科临床论文 > 全外显子组测序在儿童遗传病诊断中的应用价值

全外显子组测序在儿童遗传病诊断中的应用价值

2024-11-14 93 上传者：管理员

摘要：目的探讨全外显子组测序(WES)在儿童遗传病诊断中的应用价值。方法选取2019年4月—2022年12月温州市人民医院收治的疑似遗传病或临床诊断不明确的30例患儿为研究对象，采集患儿及其父母静脉血，对患儿进行染色体检查，同时对患儿及其父母进行WES,对检查进行分类，结合患儿临床表现寻找相关致病的变异基因，并进行Sanger测序验证。结果 30例患儿染色体检查均未发现异常，通过WES检测出有基因变异17例(56.7%)。17例基因变异的患儿中，7例(41.2%)为致病性基因变异，3例(17.6%)为可疑致病性基因变异，剩余7例(41.2%)基因变异意义未明。结论染色体检查作为遗传病的检查手段存在局限性，WES是儿童遗传病分子诊断的重要方法，可在临床决策中发挥关键作用，但WES也有一定局限性，可联合其他分子学方法进行确诊。

关键词：
WES
儿童
全外显子组测序
染色体
遗传病
加入收藏

随着国家发布《关于优化生育政策促进人口长期均衡发展的决定》,遗传病及出生缺陷在儿童疾病诊断与治疗方面日益受到人们关注[1]。但是，许多遗传病在儿童时期的临床表现不典型，给临床诊疗带来了挑战[2]。在过去，染色体检查是诊断遗传病的常规手段，但存在无法检测遗传物质微小缺失、重复、变异的弊端，造成漏检。全外显子组测序(WES)是采用序列捕获技术对全基因组内全部外显子区域内DNA序列进行捕获、浓缩并高通量测序，为发现儿童遗传病的致病基因提供了一种全新的诊断技术[3]。本研究分析了WES在温州市人民医院儿童遗传病中的临床应用情况，以期对临床诊断、治疗及遗传咨询等方面有所帮助。

1、资料与方法

1.1 资料来源

选择2019年4月—2022年12月温州市人民医院收治的疑似遗传病或临床诊断不明确的30例患儿为研究对象，男24例(80.0%),女6例(20.0%),年龄1 d～8岁。检出基因变异患儿17例(阳性率56.7%),男14例，女3例，发病年龄1 d～8岁，其中1岁以下10例，2～8岁7例。临床表现为特殊面容、胆汁淤积、喂养困难、未知原因呼吸困难、反复抽搐、肌张力异常、软腭裂、发育迟缓等；部分患儿检验结果显示有高血糖、高血氨、高乳酸、高胆汁酸、酸中毒、电解质紊乱、嗜酸性粒细胞增多、血小板减少等。

1.2 方法

1.2.1 标本采集

收集2～3 ml患儿与父母的静脉血，用EDTA-K2抗凝后放入2 ℃～8 ℃冰箱冷藏保存，并填写患儿和父母基本情况、临床表现及有关辅助检查结果等资料，标本送至杭州金域医学检验中心进行高通量WES。本研究已通过医院医学伦理审批(批号：2020220),患儿监护人及父母均签署知情同意书。

1.2.2 检测方法

1.2.2.1 标本处理

采用miniblood全血试剂盒(德国QIAGEN公司)及操作说明提取基因组DNA,采用NanoDrop紫外分光光度仪(美国Thermofisher公司)测定样本的浓度及定量。利用ClearSeq捕获试剂盒(美国AGILENT公司)对基因组DNA进行超声打断、末端修复、接头连接、杂交捕获。

1.2.2.2 测序实验

检测基于Illumina测序平台进行。所获数据在人类基因组已知基因外显子及上下游5 bp序列的平均测序深度90X,其中目标序列98%左右测序深度超过20X,所有测序片段均经过碱基识别，并采用一代Sanger测序验证经WES检测出的基因变异位点及其父母相关基因位点。

1.2.2.3 二级分析

检测主要是利用GATK(The Genome Analysis Toolkit)软件包对测序数据进行分析。测序片段由BWA和UCSChg19的参考基因组比较。单核苷酸变异和小片段插入缺失变异分析：采用VEP软件(Variant Effect Predictor)对基因突变进行注释，并结合ClinVar、OMIM(OMIM)、HGMD和gnomAD(gnomAD)等遗传病数据库、变异数据库及人群大规模测序数据库进行筛选，同时应用多种公认的计算机算法对变异的潜在致病性进行预测和分类。根据人类基因组变异学会(HGVS)的规范，对检测到的序列变异进行命名和解读。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)发表的《序列变异解读标准和指南》对单核苷酸变异和小片段插入缺失变异进行分类。使用内部专业软件，通过高通量测序数据进行拷贝数变异分析。报告中拷贝数变异评级参考ACMG和临床基因组资源中心(ClinGen)联合发布的《组成型拷贝数变异解读与报告技术标准和指南》进行分类。根据综合多方面的证据，对检测到的基因变异进行分析以确定其是否具有临床意义，临床医师结合WES检测结果以及患儿的临床表型进行综合分析解读，并参考ACMG指南最终得出临床诊断。

1.2.2.4 相关辅助检查

血常规检测、肝肾功能检测、血气分析、血糖检测、血氨检测、尿常规及串联质谱分析、腹部B超、心脏彩色多普勒超声、胸部电子计算机断层扫描、头颅核磁共振成像等。

2、结果

2.1 检出基因变异患儿的临床资料

17例患儿中，主要临床诊断为神经肌肉骨骼异常12例，内分泌代谢异常3例，血液系统异常4例，呼吸系统异常3例。30例患儿行染色体检查均未发现异常。见表1。

表117例患儿疾病名称及基因突变信息a

2.2 患儿的基因突变信息

检出基因变异的17例患儿中，根据遗传病基因变异分类[4],其中7例(41.2%)为致病性基因变异，3例(17.6%)为可疑致病性基因变异，剩余7例(41.2%)基因变异意义未明。在含致病性基因变异的7例患儿中，1例为常染色体隐性遗传病，4例为常染色体显性遗传病，2例为基因片段缺失重复。1例常染色体隐性遗传病患儿父母为杂合变异基因携带者。在4例常染色体显性遗传病患儿中，其中1例母亲携带突变基因，也有相应表型，符合遗传方式；另外3例患儿父母不携带致病基因，该变异考虑为新发变异，也可能是患儿父母携带生殖细胞嵌合型。

3、讨论

随着全新一代高通量测序技术的出现和对人类基因相关疾病研究的不断深入，研究者开辟了探索疾病病因的全新道路[5-6]。人类基因组的全外显子组是指在基因组中具有最重要功能的基因组区域的总和，这一部分占据了整个基因组序列的1%左右。大部分导致遗传疾病的基因突变发生在外显子区域，根据数据[7]显示，大约有85%的人类致病基因突变发生在外显子区域。WES技术具备一次性分析全外显子组的能力，可有效检测绝大部分遗传病，为疾病致病基因和易感基因的研究提供了一种新颖而重要的方法，在遗传病和疑难疾病的诊断中具有显著优势[8]。

研究[9]证实：WES在基因变异的遗传病中取得了较好的诊断效果。Meng等[10]对102例单基因遗传病患儿的研究结果显示：WES诊断阳性率为36.7%。陈玉兰等[11]对广州市某医院66例危重症新生儿使用WES进行诊断，阳性率为23%。齐志业等[12]对昆明市某医院45例新生儿使用WES进行诊断，阳性率为27%。本研究结果显示：WES诊断患儿遗传病的阳性率为56.7%,高于文献报道结果，分析原因与纳入研究的病例数不同相关。

在17例基因变异的患儿中，14例患儿的父母已经进行了相应的基因检测，其中9例患儿的父母是杂合致病基因携带者，5例患儿的父母没有携带致病基因。然而，这17例确诊基因遗传病患儿的染色体检查并没有发现任何异常，表明染色体检查并不能发现基因微小缺失、变异、重复，侧面证实采用WES技术检测的必要性。

儿童遗传病的诊断较困难是由于患儿的临床症状不典型[13],本研究纳入的患儿表现出多样且复杂的临床症状，其中最常见的神经肌肉骨骼异常仅占总数的40.0%,故临床医师需要基因检测来指导临床诊断。部分儿童遗传病(如代谢性疾病)进展迅速，需要依靠准确快速的检测方法进行诊断，WES技术检测到出报告时间约为1个月，对临床及时诊治及改善患儿预后至关重要。本研究中1例患儿经WES诊断为Gitelman综合征，Gitelman综合征目前无法治愈，临床治疗目的以改善症状为主，提高患儿生活质量，尤其是避免患儿出现生长发育迟缓及其他严重的并发症。早期诊断、规范治疗及定期随访复诊可使Gitelman综合征患儿获得良好预后。

对WES结果进行解读非常困难，准确鉴别和确定相关疾病的致病基因变异依旧是一个长期的难点[14]。WES结果未显示基因型与表型之间的关联，也无法排除遗传病，这与WES技术方面的局限性(如无法检测非编码区变异等)、基因与疾病之间的关联未明确、多基因遗传病、表观遗传等相关[15]。有研究[16]对疑似患遗传病的患者进行WES检测结果的重新解读和分析后发现：有15.5%的患者最终被确诊为遗传病，这主要是由于报告解读者对患者的临床表型认知不准确或患者出现了新的临床症状而导致漏诊。因此，WES检测结果的解读需要经验丰富的遗传方面的专家和临床医师共同合作，结合患儿的症状进行综合分析，以尽可能地确定临床表型与变异基因之间的相关性，以达到准确诊断患儿的目的[17]。对于因WES技术局限性造成的无法检测的基因变异，且患儿的临床表现高度怀疑遗传病时可以采用其他测序方法，如全基因组测序，该方法能够检测几乎所有基因的外显子序列、内含子序列及基因间序列，从而提高诊断率[18]。

综上所述，染色体检查不能检测基因微小缺失、变异及重复，WES技术对可疑遗传病或者诊断不明的儿童可提供有效诊断价值。然而WES技术也有其局限性，对于临床表现高度怀疑遗传病的患儿，必要时可采用全基因组测序等方法进行检测，从而提高诊断率。WES技术的有效应用、报告解读者准确的结果分析鉴定、临床医师对临床表型的全面认识三者结合可以提高儿童遗传病的诊断率，减少误诊漏诊，早诊断、早治疗，减少遗传病所致伤残率和病死率，并提供遗传咨询以实现优生优育。

参考文献:

[1]中华儿科杂志编辑委员会.儿童遗传病遗传检测临床应用专家共识[J].中华儿科杂志,2019,57(3):172-176.

[2]魏豪.全外显子组测序技术在新生儿遗传病诊断中的应用[J].国际儿科学杂志,2021,48(1):9-13.

[5]夏米西努尔·伊力克.人类基因组学研究概况及其在医学遗传学研究中的应用[J].新疆医科大学学报,2004,27(4):428-429.

[11]陈玉兰,张又祥,杨秀芳,等.全外显子测序技术在危重症新生儿遗传病中的应用价值[J].中国当代儿科杂志,2020,22(12):1261-1266.

[12]齐志业,段江,贺湘英,等.全外显子组测序在危重症新生儿单基因遗传病中的临床应用[J].中国当代儿科杂志,2019,21(7):640-643.

[14]张强.全外显子测序技术在罕见及复杂疾病中的应用[J].临床医药文献电子杂志,2019,6(79):192.

[17]张括,沈亦平,李金明.遗传病高通量测序数据分析及变异解读:问题与挑战[J].中华医学杂志,2019,99(43):3372-3377.

基金资助:浙江省温州市科研项目(Y2020580);

文章来源:蔡晓晓,童郁.全外显子组测序在儿童遗传病诊断中的应用价值[J].中国妇幼保健,2024,39(22):4507-4510.