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18F-FDG不同类型髓系白血病细胞及荷瘤裸鼠中代谢特点研究

2025-03-26 84 上传者：管理员

摘要：目的：通过体外培养髓系白血病细胞和构建荷瘤裸鼠模型，对比研究18F-氟代脱氧葡萄糖(18F-FDG)在髓系白血病中的代谢特点。方法：体外培养U937、THP-1、HL60和K562细胞，分别于18F-FDG加入后15、30、60和120min测定细胞对18F-FDG的摄取率。将4种细胞接种于裸鼠后肢皮下建立荷瘤裸鼠模型，当瘤体大小约为500 mm3时，经鼠尾静脉注射18F-FDG，在注射后60 min时行正电子发射断层成像/计算机断层扫描。采用连续病理切片苏木精-伊红染色观察荷瘤细胞形态。结果：18F-FDG与不同类型髓系白血病细胞共同孵育后，U937细胞在4个时间点的摄取率均明显高于THP-1、HL60、K562细胞（均P<0.05）;THP-1细胞在4个时间点的摄取率均高于K562细胞（均P<0.05）；前60 min内白血病细胞对18F-FDG的摄取速度较快，60 min之后摄取速度趋于稳定。成功构建了U937、THP-1、HL60、K562白血病细胞荷瘤裸鼠模型，U937荷瘤裸鼠对18F-FDG摄取值均明显高于THP-1、HL60、K562荷瘤裸鼠（均P<0.01）;THP-1和HL60荷瘤裸鼠对18F-FDG摄取值明显高于K562荷瘤裸鼠（均P<0.01）。结论：通过皮下接种法成功构建髓系白血病荷瘤裸鼠模型，在体外培养的细胞和荷瘤裸鼠模型中，急性髓系白血病细胞对18F-FDG摄取率较高，18F-FDG可能对急性髓系白血病具有更好的临床应用价值。

关键词：
18F-氟代脱氧葡萄糖
克隆性疾病
染色体重排
白血病
荷瘤裸鼠
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髓系白血病是一类造血干/祖细胞恶性克隆性疾病，包括急性髓系白血病（AML）和慢性髓系白血病，AML患者可表现出多种基因突变和染色体重排，而慢性髓系白血病的特征是BCR-ABL融合基因的存在[1]。化疗和造血干细胞移植是髓系白血病的主要治疗手段，大多数患者在治疗后可达到完全缓解，但仍有部分患者出现复发，预后较差[2-4]。骨髓穿刺活检是白血病确诊的金标准，但具有一定的风险。近年来，随着医学影像技术快速的发展，其非侵入性的成像方式成为了许多领域的重要诊断工具。　　

正电子发射断层成像/计算机断层扫描（PET/CT）可以无创地检测放射性核素在体内的分布，将病灶组织形态学特征和功能代谢学信息整合，显示肿瘤病灶及转移灶，有助于肿瘤的早期诊断和分期[5-6]。氟代脱氧葡萄糖（18F-FDG）是一种葡萄糖类似物，通过葡萄糖转运体转运到细胞内。肿瘤细胞内葡萄糖转运体1的表达上调，且己糖激酶的活性高于正常细胞，因此，肿瘤细胞对18F-FDG的摄取量增加，呈放射性浓聚影，18F-FDG PET/CT利用肿瘤细胞的这种特性进行检测和定位[7]。最大标准化摄取值（SUVmax）是PET/CT的重要参数，反映病变局部FDG摄取水平，有助于鉴别肿瘤良恶性、预测复发风险及评估预后[8]。　　目前，18F-FDG PET/CT在白血病中的研究较少，由于缺乏系统和大规模的基础和临床研究，基于18F-FDG PET/CT的白血病骨髓受累性的诊断尚未得到充分的评估[9]。因此，本研究旨在通过体外不同类型髓系白血病细胞模型和裸鼠荷瘤模型分析白血病细胞对18F-FDG的摄取情况，评估18F-FDGPET/CT在髓系白血病中的应用价值。

1、材料与方法

细胞株

人急性单核细胞白血病THP-1和U937细胞、人急性早幼粒细胞白血病HL60细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司，人慢性粒细胞白血病K562细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司。

试剂与仪器

18F-FDG（放射化学纯度>99％）由西南医科大学核医学科制备完成。胎牛血清购自以色列BI公司，RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司，青霉素-链霉素溶液购自美国Gibco公司，4%多聚甲醛购自碧云天生物技术研究所，异氟烷购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司，苏木精和伊红购自北京索莱宝科技有限公司。超净工作台购自新加坡ESCO公司，二氧化碳培养箱购自美国Thermo公司，倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司，Micro-PET/CT购自美国Siemens公司，γ 闪烁计数器购自北京华瑞森科技发展有限公司，核素活度仪购自美国CAPINTEC公司。

细胞培养

THP-1、U937、HL60和K562细胞悬浮接种于10%胎牛血清、1%青-链霉素的RPMI-1640培养基，于37℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。每2-3d进行换液和传代，取对数生长期的细胞进行实验。

体外细胞18F-FDG摄取实验

收集对数生长期的细胞离心，弃上清，PBS洗涤2遍，加入无糖培养基重悬细胞，镜下计数，按每孔细胞数1×105个接种于24孔板中，每组细胞设置3个复孔，并设置空白对照组，将24孔板置于二氧化碳培养箱内培养。饥饿培养12 h后，每孔加入2μCi（1μCi=37 kBq）放射性核素标记物18F-FDG，轻轻吹打、混匀，离心，弃上清，加入无血清、无糖RPMI-1640培养基。在加入18F-FDG后的15、30、60和120 min 4个时间点吸出孔板内细胞悬液，离心，弃上清，加入1 ml冷PBS，充分吹打、混匀，PBS洗涤2次，用 γ 闪烁计数器测定每孔细胞悬液的放射性计数。细胞18F-FDG摄取率=细胞管放射性计数/空白管放射性计数 ×100%。实验重复3次。

构建荷瘤裸鼠模型

4-5周龄SPF级雌性BALB/c-nu小鼠，体重（15±2）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物质量合格证号SCXK（京）2019-0010，于西南医科大学实验动物中心进行饲养和实验，实验动物饲养设施合格证号SYXK（川）2018-065。动物实验研究已通过西南医科大学实验动物伦理委员会审查并获得批准。每只BALB/c-nu小鼠经过连续2天腹腔注射环磷酰胺0.2 mg后，将12只裸鼠平均分为4组（THP-1、U937、HL60和K562组），在裸鼠右侧后肢皮下分别注射THP-1、U937、HL60和K562细胞，隔天观察移植瘤生长情况，采用游标卡尺测量移植瘤的长度和宽度，并计算出移植瘤体积，公式为体积=1/2× 长度 × 宽度2。

动物体内18F-FDG摄取实验

当瘤体体积约为500 mm3时，将小鼠进行固定。经尾静脉缓慢推入200μCi已稀释好的18F-FDG溶液150μl，注射完成后小鼠制动。1 h后，将小鼠进行麻醉，俯卧位摆放，并将其固定于micro-PET/CT扫描床上，利用工作站界面的定位光标进行定位，上机采集图像，计算出SUVmax。

HE染色及形态学评价

将样本进行石蜡包埋，使用石蜡切片机切片，将组织切片置于载玻片上，40℃温水浸泡。将样本切片置于二甲苯溶液中浸泡，浸泡完成后放入无水乙醇浸泡进行充分水化。PBS清洗３次，每张切片加入苏木素染液100μl，染色10 min。蒸馏水洗去残余的苏木素染液，1%盐酸乙醇进行组织样本分化，再使用蒸馏水进行冲洗。向组织切片中加入适量伊红染液，染色3 min，再使用无水乙醇进行梯度脱水，二甲苯浸泡２次，将组织切片风干，用中性树胶封片。最后使用荧光显微镜观察肿瘤样本切片的组织病理学改变并拍照。

统计学分析

使用SPSS Statistics 27.0统计软件进行统计学分析，实验结果的计量资料以均数 ± 标准差表示，单因素方差分析进行多组比较，t检验用于组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

不同类型髓系白血病细胞对18F-FDG的体外摄取结果

通过 γ 闪烁计数器对4种髓系白血病细胞中的18F-FDG进行检测，结果如表1和图1所示。U937细胞在4个时间点的摄取率均明显高于THP-1、HL60、K562细胞（均P<0.05）；THP-1细胞的摄取率明显高于K562细胞（均P<0.05），亦高于HL60细胞（60min时间点除外）（P<0.05）；HL60细胞和K562细胞的摄取率无明显差异（P>0.05）。4种白血病细胞在与18F-FDG共培养60 min以内，对18F-FDG的摄取率增长迅速，60 min后摄取效率相对稳定。

髓系白血病细胞荷瘤裸鼠模型的建立

通过皮下接种法将白血病细胞注射至裸鼠右后肢，成功构建了髓系白血病荷瘤裸鼠模型。如图2所示，不同类型髓系白血病裸鼠肿瘤生长速度不一致，同组裸鼠肿瘤生长速度也略有差异。

瘤体组织HE染色及形态学观察

将瘤体组织进行HE染色后在显微镜下观察组织病理学的变化。如图3所示，肿瘤细胞形态呈多形，胞质丰富，嗜双色性；细胞核增大，核深染，可见少量双核细胞；细胞内核仁增多，可见病理性核分裂象。病理切片结果进一步证实了髓系白血病荷瘤裸鼠模型构建成功。

不同类型髓系白血病对18F-FDG的体内摄取的变化

4组荷瘤裸鼠的18F-FDG PET/CT图像如图4所示，U937、THP-1和HL60 3组荷瘤裸鼠对18F-FDG均有不同程度的摄取，而K562组荷瘤裸鼠对18F-FDG的摄取不明显。U937、THP-1、HL60和K562荷瘤裸鼠肿瘤对18F-FDG的单位体积摄取值（SUVmax值）分别为0.729±0.053、0.309±0.024、0.293±0.034和0.066±0.002。如图5所示，U937荷瘤裸鼠对18F-FDG摄取值明显高于其他3组（均P<0.01），THP-1和HL60组荷瘤裸鼠对18F-FDG摄取值明显高于K562荷瘤裸鼠（均P<0.01），THP-1与HL60组荷瘤裸鼠对18F-FDG摄取值无明显差异（P>0.05）。

3、讨论

复发和耐药严重影响了髓系白血病患者的预后，白血病干细胞代谢特性的改变是疾病复发和对化疗药物抵抗的主要根源[9-10]。髓系白血病细胞和白血病干细胞依赖于线粒体代谢提供能量，抑制线粒体氧化磷酸化可以选择性地清除白血病干细胞[10-12]。因此，靶向识别白血病细胞中的异常能量代谢有助于治疗策略的选择。18F-FDG是一种放射性物质，作为葡萄糖类似物，与PET/CT与结合使用，可以帮助识别糖代谢异常的组织，了解AML细胞系亚型对18F-FDG摄取的影响，可能有助于判断疾病的进展[13]。　　

近年来，18F-FDG PET/CT已应用于实体肿瘤和部分血液系统肿瘤（如淋巴瘤、多发性骨髓瘤、髓系肉瘤）的诊断、治疗及预后评估[14-15]。18F-FDG PET/CT在白血病中主要用于检测白血病髓外疾病、监测髓外复发和评估治疗反应[16-17]，也可用于诊断具有18F-FDG弥漫性骨髓摄取的患者[18]。此外，Taralli等[19]研究结果显示，慢性淋巴细胞白血病患者移植后PET/CT检查可通过评估代谢状态更早地预测患者的预后。从现有的研究来看，有关18F-FDG PET/CT在白血病诊断治疗中的数据仍然有限。因此，本研究对不同类型髓系白血病细胞18F-FDG的代谢特征进行了研究。结果显示，4种髓系白血病细胞在60 min内对18F-FDG的摄取比较迅速，随后趋于稳定，其中，急性单核细胞白血病细胞（U937、THP-1）对18F-FDG摄取率明显高于急性早幼粒细胞白血病细胞（HL60）和慢性粒细胞白血病细胞（K562）。为了更好地模拟体内肿瘤的发生、发展进程，本研究通过皮下注射法建立可移植性白血病模型[20]。将处于对数生长期的白血病细胞接种于裸鼠右下肢皮下，大约1周时间可明显观察到肿瘤的形成，成功构建髓系白血病荷瘤裸鼠模型。分析结果显示，3种AML荷瘤裸鼠对18F-FDG均有不同程度的摄取，而慢性粒细胞白血病荷瘤裸鼠对18F-FDG的摄取率很低，这与细胞系实验结果类似，也与路丽彦等[21]研究显示慢性粒细胞白血病（K562）荷瘤裸鼠仅微量摄取18F-FDG的结果基本一致。　　

Stölzel等[22]进行了一项前瞻性研究，即通过18F-FDG PET/CT来确定髓外AML的发生率，共有93例AML患者在初诊时接受了18F-FDG PET/CT扫描，其中PET阳性的AML患者在随访期间、评估缓解时进行了第二次18F-FDG PET/CT扫描，结果显示，髓外AML发生率为22％，18F-FDG PET/CT检测髓外AML的敏感性为77%，特异性为97%，18FDG-PET/CT是检测髓外AML的一个有用、安全的工具。　　

本研究通过3组白血病荷瘤裸鼠模型对18F-FDG的摄取对比分析，结果提示，U937荷瘤裸鼠SUVmax最高，但THP-1荷瘤裸鼠SUVmax与HL60荷瘤裸鼠SUVmax相比无统计学差异，表明尽管U937、THP-1、HL60细胞都属于白血病细胞系，但它们所对应的荷瘤裸鼠对18F-FDG的摄取存在差异，这种差异出现的原因可能有：①进行18F-FDGPET/CT扫描的时间不同，实验环境气候、温度的差异导致18F-FDG摄取差异；②18F-FDG注射剂量有轻微的不用，这是人为所致，且较难避免；③荷瘤裸鼠瘤体大小不完全一致，虽然本研究尽量将瘤体大小控制在500 mm3，但由于瘤体测量在裸鼠体表进行，且不同裸鼠瘤体生长速率不一致，难以确保瘤体大小在行18F-FDG micro-PET/CT时完全一致；④白血病细胞株来源不完全相同，其中，U937细胞和THP-1细胞来源于人AML FAB M5型，HL60细胞则来源于M2型，众所周知，白血病细胞具有高度异质性，不同类型白血病细胞的糖代谢可存在差异。不过可以肯定的是，不论从现有的临床资料还是本研究结果来看，18F-FDG PET/CT对AML的诊断监测具有一定的临床价值。关于慢性粒细胞白血病细胞对18F-FDG摄取率低的原因并不清楚，但有资料显示，与显像剂18F-FDG相比较，3′-脱氧-3′-18F-氟代胸苷能更好地反映慢性粒细胞白血病荷瘤裸鼠模型移植肿瘤的增殖情况[21]。　　综上所述，本研究成功建立了髓系白血病荷瘤裸鼠模型，体内外实验结果表明AML细胞对18F-FDG的摄取率较高，18F-FDG可能对AML具有更好的临床应用价值。

基金资助:四川省科技计划资助(2022YFS0622);

文章来源:陈曦,严钦,覃祥,等.18F-FDG在不同类型髓系白血病细胞及其荷瘤裸鼠中的代谢特点研究[J].中国实验血液学杂志,2025,33(02):325-330.