首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 儿科论文 > 儿科实验研究论文 > 建立长效重组人生长激素-Fc融合蛋白的纯化工艺

建立长效重组人生长激素-Fc融合蛋白的纯化工艺

2020-06-18 667 上传者：管理员

摘要：目的建立长效重组人生长激素-Fc(rhGH-Fc)融合蛋白的纯化工艺｡方法rhGH-Fc融合蛋白细胞培养液经离心､低pH处理､过滤､浓缩预处理后,再经Protein-A亲和层析､CM阳离子交换层析､QHP阴离子交换层析进行纯化,同时检测rhGH-Fc融合蛋白的蛋白含量､纯度､等电点及宿主蛋白､宿主DNA､Protein-A残留量等指标｡结果Protein-A亲和层析､CM阳离子交换层析､QHP阴离子交换层析纯化产物的蛋白含量分别为145､132､92.4mg,纯度分别为95.40%､95.90%和99.19%,宿主蛋白残留量分别为2500､864和71ng/mg,宿主DNA残留量分别为329､0.56和0.12ng/mg,Protein-A残留量分别为24.5､3.2和0ng/mg｡rhGH-Fc融合蛋白相对分子质量约97300,等电点范围为5.56.5,可与鼠抗人生长激素(hGH)抗体发生特异性结合｡结论成功建立了rhGH-Fc融合蛋白的纯化工艺,该工艺的纯化产物回收率及纯度均较高,本实验为rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了理论基础｡

关键词：
实验
抗体Fc段
纯化
融合蛋白
质量检定
重组人生长激素
加入收藏

人生长激素(hGH)由人脑垂体前叶腺嗜酸性粒细胞释放,含有191个氨基酸分子,其生理功能主要为促进身体各组织､器官及骨骼中受体细胞的蛋白质合成和脂肪分解,从而调节机体代谢和生长发育｡主要的临床适用证为儿童生长激素缺乏症､严重烧伤､Tumer综合征等[1]｡目前市场上的hGH大多半衰期较短,为达到理想的治疗效果,需要较高给药频率或剂量,给患者带来了较大的痛苦及经济负担｡因此,延长hGH半衰期显得尤为重要｡目前,国内外在研的长效hGH主要有化学修饰､生物可降解微球缓释体系､融合蛋白等[2,3,4,5]｡

重组人生长激素-Fc(rhGH-Fc)融合蛋白是将hGH基因与经改造的人抗体Fc段连接,并克隆至GS双表达载体,稳定转染CHO-k1细胞筛选后,经罐培养､纯化获得[6]｡本研究采用Protein-A亲和层､阳离子层析､阴离子层析建立rhGH-Fc融合蛋白的3步纯化工艺,并进行相应质量检定,为大规模生产rhGH-Fc融合蛋白奠定基础｡

1、材料与方法

1.1细胞培养液

罐培养的rhGH-Fc融合蛋白细胞培养液由长春生物制品研究所细胞因子室制备｡

1.2主要试剂及仪器

CHOHCPELISAKit及Protein-AELISAkit购自美国Cygnus公司;CHODNA检测试剂盒购自湖州申科生物技术有限公司;高相对分子质量marker及低相对分子质量marker购自宝生物工程(大连)有限公司;彩色预染蛋白质分子量标准购自碧云天生物技术有限公司;HRP标记的山羊抗鼠IgG购自美国Invitrogen公司;鼠抗hGH抗体由长春生物制品研究所细胞因子室制备;DAB显色试剂盒(20×)购自北京索莱宝科技有限公司;ATProtein-ADiamond层析介质及QBestaroseHP层析介质购自上海博格隆生物有限公司;CMSepharoseFastFlow层析介质､26/200层析柱及AKATApurifier100购自美国GE公司;高效液相色谱仪购自美国PerkinElmerFlaxer公司;分子尺寸排阻色谱柱TSK3000SW购自日本TOSOH公司;成像毛细管等电聚焦电泳仪及μSIL-FC毛细管柱购自荣捷生物工程有限公司｡

1.3细胞培养液预处理

将rhGH-Fc融合蛋白细胞培养液经175×g离心10min,弃沉淀,收集上清,11224×g离心30min,弃沉淀;上清液中加入200mmol/L氯化钠,待其完全溶解后,用1mol/L醋酸调节pH至5.0,4℃静置20min;11224×g离心30min,用1mol/LTris调节pH至7.4;经0.45μm膜过滤,超滤浓缩2~3倍[7]｡

1.4高度纯化

1.4.1Protein-A亲和层

用含150mmol/L氯化钠的50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4)平衡ATProteinADiamond层析柱,平衡10~15个柱体积｡上样量为20~25mg/mL(蛋白质/介质),用含300mmol/L氯化钠的20mmol/L柠檬酸缓冲液(pH4.5)[7,8]连续淋洗5个柱体积,再以20mmol/L柠檬酸缓冲液(pH4.5)淋洗1个柱体积｡用20mmol/L柠檬酸缓冲液(pH3.6)洗脱蛋白,根据波长280nm的紫外吸光值收集目标蛋白,收样的同时用1mol/LTris调节pH至中性｡

1.4.2阳离子层析(CM)

CMSepharoseFastFlow阳离子层析柱用20mmol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)平衡10个柱体积后上样,亲和层析后的蛋白样品上样量为100~200mg/mL(蛋白质/介质),根据波长280nm的紫外吸光度值收集流穿液目标蛋白[9]｡收样的同时用1mol/LTris调节pH至8.0｡

1.4.3阴离子层析(QHP)

QBestaroseHP阴离子层析柱用10mmol/LTE缓冲液(pH8.0)平衡10~15个柱体积后上样,阳离子层析后的蛋白样品上样量为10~15mg/mL(蛋白质/介质),淋洗液为10mmol/LTE缓冲液(pH8.0),连续淋洗5个柱体积｡用含有160mmol/LNaCl的20mmol/LTE缓冲液(pH8.0)进行梯度洗脱,根据波长为280nm的紫外吸光度值收集目标蛋白[9]｡

1.5纯化产物的检定

1.5.1蛋白含量检测

采用《中国药典》三部(2015版)[10]通则0731Lowry法对各步纯化产物进行蛋白含量测定｡

1.5.2SEC-HPLC纯度分析

采用SEC-HPLC法对各步纯化产物进行纯度检测｡色谱柱选用TSK3000SW,流动相为含有0.3mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液(pH6.8),上样量为100μL,流速为0.6mL/min,检测波长为280nm,检测时间设为22min｡

1.5.3SDS-PAGE分析

将QHP阴离子纯化产物进行还原和非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳[11],分离胶浓度分别为12%和8%｡

1.5.4Westernblot分析

将QHP阴离子纯化产物经SDS-PAGE分离后,转移至PVDF膜,用含10%新生牛血清的TTBS缓冲液于室温封闭1h;加入鼠抗hGH抗体(1∶500稀释),于室温作用3h;用TTBS缓冲液洗涤3次,加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶10000稀释),于室温作用1h;DAB显色｡

1.5.5毛细管等电聚焦检测

采用毛细管等点聚焦电泳检测QHP阴离子纯化产物的等电点范围｡选用μSIL-FC毛细管柱,检测波长为280nm,上样量为25μL,进样器温度为室温,预聚焦电压为1.5kV,持续1min,聚焦电压为3kV,持续6min｡样品总体积为200μL,其中甲基纤维素终浓度为0.35%,载体两性电解质为4%,样品终浓度为0.4mg/mL,尿素为8mol/L,PI标准品为1%｡

1.5.6rhGH-Fc蛋白相关杂质的检测

分别采用CHOHCPELISAKit试剂盒､CHODNA检测试剂盒及Protein-AELISAkit试剂盒对各步骤纯化产物的宿主残留蛋白､宿主残留DNA､残留Protein-A含量进行检测｡

2、结果

2.1rhGH-Fc融合蛋白的蛋白含量

rhGH-Fc融合蛋白的3步层析图谱见图1｡Protein-A亲和层析､CM阳离子交换层析､QHP阴离子交换层析纯化产物的蛋白含量分别为145､132､92.4mg,回收率分别为97%､91%､70%,见表1｡

图1rhGH-Fc融合蛋白纯化层析图谱

表13步纯化工艺中目的蛋白回收率

2.2rhGH-Fc融合蛋白的SEC-HPLC纯度

Protein-A亲和层析､CM阳离子层析和QHP阴离子层析纯化样品的SEC-HPLC纯度分别为95.40%､95.90%和99.19%,见图2｡

图23步层析纯化样品的SEC-HPLC检测结果

2.3rhGH-Fc融合蛋白的SDS-PAGE分析

QHP阴离子纯化rhGH-Fc蛋白经非还原和还原聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,相对分子质量分别约97300和49500,大小均与理论值相符,见图3｡

图3rhGH-Fc融合蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.4rhGH-Fc融合蛋白的Westernblot鉴定

QHP阴离子纯化产物可与鼠抗GH抗体发生特异性结合,于相对分子质量约97300处可见特异性结合条带,见图4｡

图4QHP阴离子纯化产物的Westernblot鉴定

2.5rhGH-Fc融合蛋白的等电点

QHP阴离子纯化产物的等电点范围为5.5~6.5,见图5｡

2.6rhGH-Fc融合蛋白相关杂质的检测结果

Protein-A亲和层析､CM阳离子层析和QHP阴离子层析纯化样品的宿主残留蛋白分别为2500､864､71ng/mg,宿主残留DNA分别为329､0.56､0.12ng/mg,残留Protein-A含量分别为24.5､3.2､0ng/mg｡

图5rhGH-Fc融合蛋白毛细管等点聚焦电泳图谱

3、讨论

融合蛋白药物生产过程中会产生许多影响产品质量的杂质,主要包括聚体､宿主残留蛋白､宿主残留DNA､脱落的Protein-A､内毒素等｡本实验中,由于采用CHO细胞表达外源蛋白,残留宿主细胞蛋白､宿主残留DNA及在蛋白纯化过程中引入的Protein-A杂质是影响产品质量的主要原因｡目前Protein-A亲和层析作为第1步抗体及Fc融合蛋白捕获阶段仍为最为有效的方法,在抗体及Fc融合蛋白纯化工艺中占主导地位｡

本研究以Protein-A亲和层析作为纯化工艺第1步,其洗脱液中仅含有少量的高分子聚合物､宿主残留蛋白､残留DNA､Protein-A等杂质,蛋白纯度可达95.7%｡根据相关文献报道,CHO宿主残留蛋白大多数等电点范围在4.5~7.0之间[12,13],根据目的蛋白与宿主蛋白等电点的差异,在亲和层析后,采用阳离子和阴离子层析进行进一步纯化[14],由于rhGH-Fc蛋白在酸性条件下不稳定,易产生沉淀,因此选用阳离子流穿模式进行纯化,试验结果表明,阳离子交换层析虽在提高纯度方面效果不明显,但可有效去除宿主残留蛋白､残留DNA､Protein-A,再经阴离子层析,可最大程度去除宿主残留蛋白､宿主残留DNA､Protein-A､聚合体｡

本研究成功建立了rhGH-Fc融合蛋白纯化工艺,经3步纯化后样品纯度达99%以上,蛋白回收率达60%以上,宿主残留DNA含量为0.12ng/mg,宿主残留蛋白含量低于100ng/mg,Protein-A蛋白含量为0,毛细管电泳检测到目的蛋白等电点范围为5.5~6.5,与理论值一致,且纯化蛋白可与GH抗体发生特异性结合,表明蛋白正确｡采用本实验建立的纯化工艺获得的rhGH-Fc融合蛋白回收率及纯度均较高,为大规模生产该蛋白奠定了理论基础｡

参考文献：

[1]包建华.重组人生长激素的临床应用进展[J].药学服务与研究,2008(4):272-275.

[2]唐姝,陈志祥,陆伟根.重组人生长激素长效制剂的研究进展[J].世界临床药物,2014,35(1):36-41.

[6]俞露,刘玉林,申兆兴,等.rhGH-Fc工程细胞的构建及筛选[J].中国生物制品学杂志,2016,29(10):1021-1026.

[7]陈泉,卓燕玲,许爱娜,等.蛋白A亲和层析法纯化单克隆抗体工艺的优化[J].生物工程学报,2016,32(6):807-818.

[10]国家药典委员会.中华人民共和国药典(三部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:788.

[11]萨姆布鲁克J,拉塞尔DW.分子克隆实验指南[M].3版.黄培堂.译.北京:科学出版社,2002.

郭胜苍,俞露,富瑞丽,王莹,刘玉林,张宇,王江林,刘涵.长效重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺的建立[J].中国生物制品学杂志,2020,33(06):705-708+713.