卵巢癌是女性中比较常见的生殖系统恶性肿瘤，其发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，但由于卵巢位于盆腔内，解剖位置深，发病隐匿，同时缺乏早期诊断手段，卵巢癌死亡率居妇科恶性肿瘤首位，已成为威胁女性健康的主要肿瘤(Jemal et al.,2011)。但卵巢癌的发病机制仍不明确。SPOP蛋白(speckle-type POZ protein)，亚细胞结构呈核内散布，它是E3泛素连接酶CUL-3骨架蛋白的接头分子，共同构成E3泛素连接酶复合体，可泛素化降解能与其特异性结合的蛋白分子。目前研究已发现PDX-1、MacroH2A、Daxx以及Gli2、Gli3等均可被SPOP组成的E3泛素连接酶复合体降解，同时SPOP蛋白也可作为底物被泛素化修饰及降解(Bunce et al.,2008;Liu et al.,2009)。近年来，SPOP在肿瘤发生发展中所起的作用成为研究热点。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶(phosphatidylino-sitol 3-kinase/serine/threonine kinase,PI3K/AKT)为受体酪氨酸激酶(RTKs)信号通路，包括VEGF receptor、PDGF receptor、EGF receptor等在内的RTKs都能通过PI3K/Akt级联信号通路来调控肿瘤细胞功能，影响着人类多种恶性肿瘤发生发展。当细胞受到外界刺激，产生相应的配体，配体通过与细胞膜表面相应的受体分子结合，将细胞外信号传递到细胞内，激活受体酪氨酸激酶，激活的受体酪氨酸激酶使PI3K活化，活化的PI3K通过PDK1磷酸化Akt使其活性增强。活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游一系列底物如促促凋亡因子Bad、caspase9、凋亡信号调节激酶ASK1、核因子NF-κB、叉头框转录抑制因子FOXO等，从而调节肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、迁移、侵袭等生物学行为及肿瘤组织中新生血管的生成等重要病理过程；目前研究发现在女性生殖系统恶性肿瘤、消化系统恶性肿瘤等多种肿瘤中均存在AKT的活化，AKT的活化对肿瘤治疗及预后具有重要作用(Williams et al.,2009;Dasari et al.,2010;Xiong et al.,2010)。本研究探索SPOP在卵巢癌的发生与生长过程中的生物学作用，发现SPOP在增强卵巢癌细胞的迁移及侵袭能力中发挥重要作用，且与磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶信号通路密切相关。

1、结果与分析

1.1组织芯片各组织中SPOP蛋白表达情况

卵巢癌组织芯片中100例组织除2例上皮型卵巢癌组织因标本处理问题不可统计以外，其余组织均可纳入统计分析其中。所有10例正常卵巢组织中SPOP蛋白表达呈阴性(图1A)。88例卵巢癌组织除13例卵巢癌组织SPOP蛋白表达呈阴性外(图1 B)，其余卵巢癌组织SPOP蛋白表达均为阳性(图1C;图1D图1E;图1F)。其中，72例上皮型卵巢癌组织SPOP表达：32例(+)、34例(++)、6例(+++)；16例其余类型的表达：13例(-)、3例(+)。上皮型卵巢癌组织中SPOP表达明显高于其余类型组织中的表达。

图1各组IHC染色

1.2 SPOP表达情况

卵巢表皮上皮细胞HOSE细胞(0.065±0.007)中SPOP mRNA水平明显低于卵巢浆液性细胞癌细胞株OVCAR-3细胞(1.000±0.000)及SKOV3细胞(0.445±0.071)；且OVCAR-3细胞中SPOP mRNA水平最高(图2A)。分析3种细胞株中SPOP蛋白表达((1.244±0.006);(2.272±0.105);(1.487±0.020))同m RNA表达(图2B;图2C)。

1.3慢病毒转染对HOSE、OVCAR-3细胞SPOP mRNA和蛋白水平的影响

采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹分析(Western blotting)检测用嘌呤霉素筛选的过表达组(o-spop)、过表达空载组(o-nc)、敲低组(sh-spop)、敲低空载组(sh-nc)细胞的SPOP mRNA和蛋白水平(图3A;图3B;图3C)。在HOSE细胞中，o-nc组与sh-nc组的SPOP mRNA水平表达无差异((0.845±0.030);(0.927±0.003))；而o-spop组和sh-spop组的SPOP出现明显的表达上调及下调差异((8.231±0.376);(0.110±0.005))。OVCAR-3细胞各组的SPOP m RNA表达水平与HOSE中的表达水平一致((0.949±0.267);(0.932±0.003);(7.514±0.581);(0.101±0.004))。sh-nc、sh-spop、o-spop、o-nc各组的蛋白表达水平在HOSE细胞((0.639±0.001);(0.427±0.033);(0.622±0.008);(1.168±0.005))、OVCAR-3细胞((1.020±0.036);(0.623±0.015);(1.010±0.064);(2.000±0.105))中与m RNA相一致。

1.4 Annexin V-FITC检测慢病毒转染细胞凋亡情况

根据流式细胞仪检测结果(图4A)，统计结果(图4B)显示慢病毒转染OVCAR-3细胞的过表达组(o-spop)、过表达空载组(o-nc)、敲低组(sh-spop)、敲低空载组(sh-nc)细胞的凋亡差异无统计学意义((0.059±0.002);(0.067±0.023);(0.069±0.025);(0.058±0.005),p>0.05)。

1.5慢病毒转染对OVCAR-3细胞增殖活性的影响

采用CCK8法测定慢病毒转染的过表达组(o-spop)、过表达空载组(o-nc)、敲低组(sh-spop)、敲低空载组(sh-nc)细胞的增殖活性(图4C)，但各组增殖活性差异无统计学意义((0.737±0.037);(0.763±0.032);(0.727±0.037);(0.757±0.051),p>0.05)。

1.6慢病毒转染对OVCAR-3细胞迁移能力的影响

Transwell迁移试验结果显示过表达组(o-spop)、敲低组(sh-spop)的穿膜细胞数分别为(351.3±17.62)个和(204±4.6)个，过表达组明显高于过表达空载组(o-nc)组的(250.6±10.6)个，敲低组低于敲低空组(sh-nc)(246.6±10.7)，差异有统计学意义(p<0.05)(图5)。

1.7慢病毒转染对OVCAR-3细胞侵袭能力的影响

Transwell迁移试验结果显示过表达组(o-spop)、敲低组(sh-spop)组的穿膜细胞数分别为(212±10.1)个和(83.3±4.2)个，过表达组高于过表达空(o-nc)组的(106.7±5.1)个，敲低组低于敲低空(sh-nc)组(108±4.6)，差异有统计学意义(p<0.05)(图6)。

1.8慢病毒转染OVCAR-3细胞对PI3K-AKT信号通路相关蛋白表达影响

Western blotting检测结果显示，构建慢病毒转染OVCAR-3细胞过表达(o-spop)及敲低(sh-spop)SPOP可以通过PI3K-AKT信号通路从而影响下游效应蛋白p-GSK3β((0.357±0.034);(1.160±0.085))和MM-P-9((0.870±0.093);(0.324±0.022))的表达，差异有统计学意义(p<0.05)(图7)。

图2 SPOP在ovcar-3,skov3,hose细胞株的表达

图3各组细胞SPOP m RNA及蛋白表达水平

图4 Annexin V-FITC/PI检测OVCAR-3细胞凋亡

2、讨论

SPOP属于一种包含BTB/POZ结构域的蛋白，最先作为E3泛素化连接酶的组分被人们发现(Mani,2014)。目前研究发现SPOP基因在子宫内膜癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌和前列腺癌等存在杂合性缺失现象，在多数肿瘤中扮演抑癌基因的作用(Barbieri et al.,2012;Kim et al.,2013;Zeng et al.,2014)。但研究表明SPOP在肾透明细胞癌中则具有促进肿瘤发生发展的作用(Li et al.,2014;刘全海等,2017)。本研究着重研究SPOP在卵巢癌细胞迁移及侵袭方面的功能，结果表明SPOP能显著促进卵巢癌细胞迁移及侵袭能力，这体现了SPOP在卵巢的肿瘤发生迁移及侵袭发挥作用，与免疫组化研究显示卵巢癌中SPOP的表达水平明显高于正常卵巢组织的结果相符。

GSK3β是一个在蛋白合成、细胞增殖、细胞分化和细胞运动等生理过程中发挥重要作用的蛋白激酶(Shimura,2011)。GSK3β的活性主要由不同位点的磷酸化状态决定。该位点并不位于C端，而是定位于N端丝氨酸-9及酪氨酸-216，这两处的磷酸化修饰可分别降低和提高它的活性。定位于细胞质中GSK3β只有在进入细胞核之后，其生物学的活性才得以发挥(Forde and Dale,2007;Zeng et al.,2014)。PI3K可以与AKT分子相互作用，使GSK-3β失活，GSK-3β是Wnt通路的关键组分，可能会导致β-catenin在细胞核中蓄积，这是EMT启动的标志之一(Song et al.2017)。鉴于前期研究证明通过化学药物抑制GSK3β的活性后，抑制基质金属蛋白酶-9的表达从而抑制口腔鳞状细胞癌发展和侵袭的作用(Pramanik et al.2017)。故本研究着重研究通过激活PI3K-AKT通路从而促进p-GSK3β(Ser9)表达以及MMP9的表达从而初步确定GSK3β的失活抑制MMP9活性，从而抑制卵巢癌细胞的迁移侵袭能力。

图5慢病毒转染后Transwell检测ovcar-3细胞迁移能力

图6慢病毒转染后Transwell检测ovcar-3细胞侵袭能力

图7 Western blottimg检测慢病毒处理ovcar-3细胞p-PI3K-Akt信号通路相关蛋白表达水平

转移过程包括ECM和基底膜细胞粘附的改变，随着ECM和基底膜细胞的降解，癌细胞从原发部位的分离，侵入血管和在远处建立新的肿瘤(Chen et al.,2017)。MMPs是锌依赖性内肽酶家族，由于它们消化胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和蛋白聚糖等基底膜和ECM蛋白，因此对促进癌细胞侵袭和转移至关重要。MMPs(MMP-1,MMP-2和MMP-9)的过度表达与肿瘤分期，组织学分级、进展、微脉管系统侵袭和远处转移有关(Liu et al.,2010;Wang et al.,2015)。研究结果表明当过表达SPOP后，可以使卵巢癌细胞MMP9高表达，从而有利于卵巢癌细胞发生侵袭和迁移。

综上所述，本实验首次对SPOP在卵巢癌组织的表达及其对卵巢癌细胞的生物学作用进行了探究，完善了SPOP的疾病表达谱和组织表达谱，明确了SPOP促进卵巢癌细胞迁移及侵袭的作用。本研究揭示了SPOP对于卵巢癌治疗及预后存在潜在意义。但其具体和更深入的作用机制以及在卵巢癌中的发生和治疗作用还有待进一步深入研究。

3、材料与方法

3.1主要实验动物、细胞及试剂

卵巢癌组织芯片(BC11115b)购于Alenabio公司，其中包括边缘组织10例，卵巢癌组织90例；90例卵巢癌组织按组织病理分型包括子内膜样卵巢癌1例，透明细胞性卵巢癌5例，粘液性上皮性卵巢癌12例，浆液性上皮性卵巢癌62例，淋巴转移性腺癌10例。SKOV3细胞、HOSE细胞获取自重庆医科大学吴兰香研究小组；OVCAR-3细胞来自重庆医科大学附属第一医院令狐华教授惠赠。主要试剂：SP法免疫组化染色试剂盒、Alexa Fluor 594荧光二抗(中杉金桥)、HE染色试剂(重庆医科大学大学生命科学研究院)、1640(Gibco)、DMEM高糖(Gibco)、胎牛血清(Cellmax)、SPOP抗体(Proteintech)、p-Akt抗体(cst)、MMP9抗体(碧云天)、p-PI3K抗体(碧云天)、EGFR抗体(碧云天)、p-GSK3β抗体(碧云天)。

3.2方法

3.2.1组织芯片中SPOP免疫组织化学表达量检测

组织芯片脱蜡至水，胰蛋白酶37℃抗原修复3～5 min，按照sp-9001免疫组化试剂盒说明书进行(spop一抗1∶250稀释)，脱水、透明后封片拍照，阳性反应为细胞胞浆和胞核中黄褐色沉淀。观察方法：每张切片在400×光学显微镜下随机选取视野拍摄。

3.2.2正常卵巢表皮上皮细胞株及卵巢癌细胞株培养

HOSE细胞株及SKOV3、OVCAR-3细胞株培养条件：HOSE和OVCAR-3细胞株培养基成分(RP MI-1640,双抗(100UPCN,100USM),10%FBS);SKOV3细胞株培养基成分(DMEM高糖,双抗(100UPCN,100-USM)和10%FBS)。放入37℃、5%CO2细胞培养箱孵育。当细胞融合度达90%时使用0.125%胰蛋白酶消化制备成细胞悬液进行传代培养。

3.2.3 RT-PCR检测SPOP的表达

反转录实时定量聚合酶链反应(Real time-PCR)收集HOSE细胞、OVCAR-3细胞、SKOV3细胞，采用Trizol法提取细胞RNA，按照反转录试剂盒说明书操作将RNA反转录成cDNA，取1μL cDNA采用SYBERⅡ进行实时荧光定量PCR反应。引物序列如下：SPOP(GCCCTCTGCAGTAACCTGTC(Forward),GTCTCCAAGACATCCGAAGC(Reverse))；βactin(TG GCACCCAGCACAATGAA(Forward),CTAAGTCAT AGTCCGCCTAGAAGCA(Reverse))。

3.2.4 Western blotting检测SPOP蛋白的表达

将HOSE、SKOV3、OVCAR-3细胞接种至10 cm培养皿中，待细胞融合度至90%左右时，收集细胞分别提取HOSE、SKOV3、OVCAR-3细胞总蛋白。BCA法测定细胞总蛋白浓度(参照说明书)，利用Western blotting检测SPOP的蛋白表达情况。

3.2.5构建慢病毒稳转细胞株

将OVCAR-3、HOSE细胞分别接种于2个24孔板，200μL/孔，待细胞融合度达50%左右时，根据病毒滴度，将过表达及干扰SPOP慢病毒和其相应的空载组慢病毒分别加入相对应的孔内，置于37℃、5%CO2细胞培养箱孵育48 h。

3.2.6 PT-PCR检测转染后细胞株SPOP表达

将转染后HOSE及OVCAR-3细胞株过表达组(o-spop)、过表达空载组(o-nc)、敲低组(sh-spop)、敲低空载组(sh-nc)分别种在六孔板中，转染后的细胞株加入嘌呤霉素筛选后，当细胞融合度达90%，收集细胞，用Trizol法提取各组细胞的RNA，按照反转录试剂盒说明书操作将RNA反转录成cDNA，取1μL LcDNA采用SYBERⅡ进行Realtime-PCR反应。PCR反应于BioRad PCR仪内进行。PCR所用引物序列如下：SPOPGCCCTCTGCAGTAACCTGTC(Forward),GTCTCCAAGACATCCGAAGC(Reverse)；β-actin:TGGCACCCAGCACAATGAA(Forward),CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA(Reverse)。

3.2.7 Western blotting检测转染后细胞株SPOP蛋白的表达

将转染后的HOSE、OVCAR-3细胞过表达组(o-spop)、过表达组(o-nc)、敲低组(sh-spop)、敲低空载组(sh-nc)分别接种至10 cm培养皿中，待细胞融合度至90%左右时，收集细胞提取各细胞蛋白。BCA法测定各细胞总蛋白浓度后，利用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测SPOP的蛋白表达情况。

3.2.8流式细胞仪检测转染后细胞凋亡

分别取处于对数生长期的转染后OVCAR-3细胞过表达组(o-spop)、过表达空载组(o-nc)、敲低组(sh-spop)和敲低空载组(sh-nc)4组细胞以1×105个/孔的密度接种于6孔板，待细胞融合度达90%时，用0.125%胰酶消化后，离心收集所有细胞，采用Annexin V-PI双染，流式细胞仪检测细胞凋亡。

3.2.9 CCK8检测转染后细胞增殖能力

将慢病毒转染处于对数生长的OVCAR-3细胞悬液接种96孔培养板中，每孔200μL，含8×103个细胞。实验设空白组、肿瘤细胞阴性对照组、过表达组、过表达空载组、敲低组、敲低空载组。将培养板置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中常规培养24 h后，饥饿细胞8 h后，各孔均加入5 mg/mL的CCK8溶液10μL放入37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱继续培养4 h后，以酶标仪于450 nm处读取各孔吸光度值(A450)。肿瘤细胞的增值率=(实验组-空白对照组)/(阴性对照组-空白对照组)×100%，空白组吸光度值设为0值。实验重复4次，取平均值。

3.2.1 0 Transwell小室检测转染后细胞迁移能力

取对数生长期转染后OVCAR-3细胞过表达组(o-spop)、过表达空载组(o-nc)、敲低组(sh-spop)和敲低空载组(sh-nc)4组用0.25%胰酶消化离心后使用无血清培养基调整细胞密度为5×104个/mL接种到相对应的Transwell小室，并将Transwell小室置于24孔板对应的孔内，上室内为无血清1640培养基，下室为含10%胎牛血清(FBS)1640培养基。放入孵箱培养36 h后用棉签头擦掉小室内细胞，室温下，将小室放入4%多聚甲醛固定30 min，再将小室放入0.1%结晶紫染色，待其自然风干后于显微镜200×视野下拍照，随机选取5个200×视野计算穿膜细胞数。实验重复3次。

3.2.1 1 Transwell小室检测转染后细胞侵袭能力

Transell小室置于24孔板内，基质胶与1640按1∶7比例配置，每个小室内加入60μL配好的基质胶，24孔板放入置于37℃、5%CO2细胞培养箱过夜。取对数生长期过表达组(o-spop)、过表达空载组(o-nc)、敲低组(sh-spop)和敲低空载组(sh-nc)4组OVCAR-3细胞用0.25%胰酶消化离心用无血清培养基调整细胞密度为1×105个/mL接种到Transwell小室，并将Transwell小室置于24孔板相对应的孔内，上室内为无血清1640培养基，下室为含10%胎牛血清(FBS)1640培养基。放入孵箱内培养36 h后用棉签头擦掉小室内细胞，室温下，4%多聚甲醛固定30 min，再将小室放入0.1%结晶紫染色，待其自然风干后于显微镜200×视野下拍照，随机选取5个200×视野计算穿膜细胞数。实验重复3次。

3.2.1 2 Western blotting检测转染后细胞株PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达

将慢病毒转染OVCAR-3细胞过表达组(o-spop)、过表达空载组(o-nc)、敲低组(sh-spop)、敲低空载组(sh-nc)分别种至10 cm培养皿中，待细胞融合度至90%左右时，收集细胞分别提取过表达组、过表达空载组、敲低组、敲低空载组细胞总蛋白。使用BCA法分别测定各细胞总蛋白浓度后，利用Western blotting检测P-PI3K、P-AKT、MMP9、GSK3β等蛋白表达情况。

3.3统计学方法

采用SPSS21.0软件包进行统计分析。采用One-way ANOVA检验方法比较多个样本均数间差异，组间两两比较采用LSD-t检验；2组独立样本数据比较使用独立样本t检验。所有数据均以均数±标准差(±s)表示，检验水准α=0.05。

参考文献:

[8]刘全海,赵文彩,申骏龙,周建成,杜双宽,程永毅,孙羿,屈卫星,2017,SPOP促进SETD2蛋白的降解并增强肾癌细胞的体外成瘤与增殖能力,现代肿瘤医学,25(13):2019-2023.

李若涵,袁冬,余秋波,罗婧,李颜希,孙一瑄,杨竹.SPOP对卵巢癌细胞生物学行为的影响及其分子机制的研究[J].基因组学与应用生物学,2020,39(04):1878-1885.

基金:重庆市卫生局医学科研计划项目(编号:2012-1-039);重庆市渝中区科技计划项目(编号:20110303)共同资助