首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 内科论文 > 肺结核论文 > 甘草酸二铵减轻肺结核模型大鼠肺损伤

甘草酸二铵减轻肺结核模型大鼠肺损伤

2024-10-31 21 上传者：管理员

摘要：目的探讨甘草酸二铵(DG)对肺结核模型大鼠肺损伤的影响。方法构建肺结核大鼠模型，将造模成功大鼠随机分为模型组(model组)、甘草酸二铵低、中、高剂量组(L-DG、M-DG、H-DG组)、甘草酸二铵高剂量+过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)抑制剂组(H-DG+GW9662组),另取18只作为对照组(control组);检测肺组织结核分枝杆菌(Mtb)菌落数；HE染色检测肺组织病理学变化；TUNEL检测肺组织细胞凋亡；ELISA检测血清炎性因子水平；Western blot检测肺组织PPARγ、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)/p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)表达。结果模型组较对照组肺组织结构破坏严重，产生大量增生型结核结节，肺泡形态发生变化，炎性细胞浸润明显，甚至出现干酪样坏死现象，结核菌菌落数增多，细胞凋亡率、TNF-α、IL-6、IFN-γ、COX-2水平及p-p38MAPK/p38MAPK表达升高，PPARγ表达降低(P<0.05)。L-DG、M-DG、H-DG组较模型组肺组织结构、肺泡形态、炎性细胞浸润、干酪样坏死等现象均有所改善，结核菌菌落数减少，细胞凋亡率降低，TNF-α、IL-6、IFN-γ、COX-2水平及p-p38MAPK/p38MAPK表达降低，PPARγ表达升高，其中H-DG组变化最显著(P<0.05)。GW9662处理可部分逆转DG对肺结核大鼠的肺损伤改善作用。结论 DG可改善肺结核大鼠的肺损伤，其作用机制可能与激活PPARγ/p38MAPK通路有关。

关键词：
DG
MTB
甘草酸二铵
肺结核是由结核分枝杆菌
过氧化物酶体增殖物激活受体γ/p38丝裂原活化蛋白激酶通路
加入收藏

肺结核是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的慢性传染疾病，是全球十大传染病之一，具有高发病率与死亡率。近年来中国肺结核发病率呈上升趋势，严重威胁患者生命健康[1]。已知结核分枝杆菌是传染病病原体之一，破坏性极强，它可逃避或调节宿主的免疫反应，炎性因子大量表达，加剧炎性反应，肺损伤加重，故抑制炎性反应成为有效治疗肺结核病的关键[2]。目前主要用异烟肼、利福平等药物进行治疗肺结核，疗程长且易出现耐药性，易对肝等器官造成损伤，寻求新的治疗药物成为肺结核目前的研究重点。甘草酸二铵(diammonium glycyrrhizinate, DG)提取自中药甘草，具有抗炎、抗氧化、免疫调节等多种作用。研究显示，其可减轻百草枯诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤[3]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ/p38丝裂原活化蛋白激酶(peroxisome proliferator activated receptor gamma/p38 mitogen-activated protein kinase, PPARγ/p38MAPK)通路是一个炎性相关通路参与结核分枝杆菌引发的炎性反应，激活PPARγ/p38MAPK通路可抑制结核分枝杆菌感染巨噬细胞的炎性反应[4]。DG能否通过调节PPARγ/p38MAPK通路影响肺结核大鼠肺损伤尚不明确，本研究主要探索DG对肺结核大鼠肺损伤及PPARγ/p38MAPK通路的影响，以期为肺结核的治疗提供理论参考。

1、材料与方法

1.1 主要材料

体质量为200～220 g的SPF级SD雄性大鼠[武汉云克隆动物有限公司，生产许可为SCXK(鄂)2023-0021]。温度25 ℃左右，湿度55%左右，12 h光照，自由饮食摄水的环境下饲养。甘草酸二铵注射液(DG, 江苏神龙药业有限公司);PPARγ抑制剂GW9662(MCE公司);结核分枝杆菌(Mtb, 中国药品生物制品检定所);HE染色试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司);TNF-α、IL-6、IFN-γ ELISA试剂盒和TUNEL染色试剂盒(上海碧云天生物公司);COX-2 ELISA试剂盒(上海富雨生物科技有限公司);兔源PPARγ抗体(Abcam公司);p38MAPK、p-p38MAPK抗体(Santa Cruz Biotechno-logy公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组与处理：

将造模成功90只大鼠随机分为模型组(model组):先将结核分枝杆菌加入0.9%氯化钠溶液混匀，接种在斜面培养基，37 ℃培养5周，制含菌量5 mg/mL的菌悬液，取0.2 mL进行大鼠尾静脉注射，建立肺结核模型[5]。甘草酸二铵低、中、高剂量组(L-DG、M-DG、H-DG组，7.5、15、30 mg/kg)和甘草酸二铵高剂量+PPARγ抑制剂组(H-DG+GW9662组)干预模型组，每组18只，另取18只作为对照组(control组);HE染色显示肺组织出现大量增生型结核结节，炎性细胞浸润明显，肺组织形态被破坏，肺损伤严重，表示模型构建成功。L-DG、M-DG、H-DG组[6]:分别注射7.5、15、30 mg/kg甘草酸二铵注射液；H-DG+GW9662组[7]:注射30 mg/kg甘草酸二铵注射液及10 mg/kg GW9662;对照组和模型组大鼠注射等量无菌0.9%氯化钠溶液。每天1次，持续21 d。

1.2.2 结核杆菌菌落的计数：

用药结束后麻醉大鼠，颈动脉取血，低温离心取上清，-80 ℃保存。处死大鼠，取出左肺，各组任选6个左肺剪碎，一部分加入预冷RIPA裂解液制成匀浆，4 ℃ 1 000 r/min离心20 min, 取上清，-80 ℃保存。一部分加入0.9%氯化钠溶液制备菌悬液，硫酸消化后斜面培养基37 ℃培养5周，进行菌落计数。其余左肺液氮-80 ℃保存。

1.2.3 ELISA检测炎性因子水平：

颈动脉血分离血清，ELISA试剂盒检测血清TNF-α、IL-6、IFN-γ、COX-2水平。

1.2.4 HE染色检测肺组织病理学变化：

4%多聚甲醛固定左肺组织，石蜡中包埋并切片，常规脱蜡水化，室温下依次加入苏木精-伊红染色液染色。干燥封片后显微镜观察肺组织切片。

1.2.5 TUNEL检测肺组织细胞凋亡：

左肺组织制成冰冻切片，蛋白酶K消化，再加入TUNEL反应液避光孵育，加入DAPI避光孵育，脱水透明封片，荧光显微镜观察呈绿色荧光的TUNEL阳性细胞数量，计算TUNEL细胞阳性率。

1.2.6 Western blot检测PPARγ/p38MAPK通路相关蛋白：

提取左肺匀浆上清总蛋白质，BCA法定量。随后蛋白质变性，凝胶电泳后湿转膜，血清封闭，将膜与兔源PPARγ、p38MAPK、p-p38MAPK一抗低温孵育过夜，再将其与羊抗兔二抗室温孵育2 h, 最后采用ECL显影，拍照并根据条带吸光度定量得出各蛋白质相对表达量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0进行统计分析，计量数据用均值±标准差

表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两之间比较行LSD-t检验。

2、结果

2.1 DG对肺结核大鼠肺组织结核杆菌菌落数的影响

模型组较对照组肺组织结核杆菌菌落数增多(P<0.05);L-DG、M-DG、H-DG组较模型组肺组织结核菌菌落数减少，H-DG组变化最为显著(P<0.05);H-DG+GW9662组较H-DG组肺组织结核杆菌菌落数增多(P<0.05)(图1)。

图1 各组肺结核大鼠肺组织结核杆菌菌落数比较

2.2 DG对肺结核大鼠炎性因子水平的影响

模型组较对照组TNF-α、IL-6、IFN-γ、COX-2水平升高(P<0.05);L-DG、M-DG、H-DG组较模型组TNF-α、IL-6、IFN-γ、COX-2水平降低，H-DG组变化最为显著(P<0.05);H-DG+GW9662组较H-DG组TNF-α、IL-6、IFN-γ、COX-2水平升高(P<0.05)(图2)。

2.3 DG对肺结核大鼠肺组织病理学变化的影响

对照组肺组织结构正常，肺泡清晰，无明显病理变化；模型组较对照组肺组织结构破坏严重，产生大量增生型结核结节，肺泡形态发生变化，炎性细胞浸润明显，甚至出现干酪样坏死现象；L-DG、M-DG、H-DG组较模型组肺组织结构、肺泡形态、炎性细胞浸润、干酪样坏死等现象均有所改善，其中H-DG组改善最显著；H-DG+GW9662组较H-DG组肺组织结构破坏、肺泡形态变化、干酪样坏死纤维化、炎性浸润、充血严重(图3)。

2.4 DG对肺结核大鼠肺组织细胞凋亡的影响

模型组较对照组细胞凋亡率升高(P<0.05);L-DG、M-DG、H-DG组较模型组细胞凋亡率降低，H-DG组变化最为显著(P<0.05);H-DG+GW9662组较H-DG组细胞凋亡率升高(P<0.05)(图4A,B)。

2.5 DG对肺结核大鼠PPARγ/p38MAPK通路相关蛋白的影响

模型组较对照组PPARγ表达降低，p-p38MAPK/p38MAPK表达升高(P<0.05);L-DG、M-DG、H-DG组较模型组PPARγ表达升高，p-p38MAPK/p38MAPK表达降低，H-DG组变化最为显著(P<0.05);H-DG+GW9662组较H-DG组PPARγ表达降低，p-p38MAPK/p38MAPK表达升高(P<0.05)(图5A,B)。

3、讨论

肺结核主要表现为低热胸闷、四肢乏力、免疫力减低、咳嗽等，还可引发持续炎性和组织损伤等相关疾病，对其他器官造成损害[8]。而目前常用治疗肺结核的药物，其治疗疗程长且具有较强副作用，故寻求新的治疗药物至关重要。甘草酸二铵作为甘草主要有效成分，具有抗炎，抗氧化，免疫调节，激素水平调节等多种生物学功能。研究显示，DG可降低白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)水平减轻炎性反应，增强免疫功能，改善慢性阻塞性肺疾病[9]。DG可有效改善肺结核抗结核引起的药物性肝损伤患者的肝功能[10]。本文研究显示，DG可改善肺结核大鼠的肺损伤。

图2 各组肺结核大鼠炎性因子水平比较

图3 HE染色观察各组大鼠肺组织病理学变化情况

图4 各组大鼠肺组织细胞凋亡检测

肺结核的发生与体内发生过度炎性反应及细胞凋亡息息相关，当结核分枝杆菌感染肺部巨噬细胞，其凋亡加快，引起炎性反应、氧化应激反应，加剧肺部病理损伤。研究显示，肺结核发生后结核杆菌菌落数升高，机体内炎性因子水平上升，降低IL-6、γ干扰素(interferon-γ, IFN-γ)、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)、TNF-α表达，可减轻机体内炎性反应，减轻肺组织损伤[11-12]。抑制结核杆菌感染及肺组织巨噬细胞凋亡，可减轻肺部炎性损伤[13]。本文研究结果显示，DG可降低TNF-α、IL-6、IFN-γ、COX-2水平，抑制肺组织巨噬细胞凋亡，改善肺结核大鼠的肺损伤。

炎性相关通路PPARγ/p38MAPK参与肺结核炎性反应。PPARγ是一种核转录因子，参与调节细胞增值代谢、炎性反应等生物进程，其激活可抑制多种炎性相关性疾病转录因子如NF-kappa-B等，抑制TNF-α、IL-6水平，抑制炎性反应[14]。p38MAPK通路是一个连续的蛋白激酶反应链，当其被激活可促进其磷酸化，激活下游NF-kappa-B等转录因子，促进TNF-α、IL-6等炎性因子释放，引发炎性反应[15]。研究显示，硅油素可通过激活PPARγ,抑制MAPK信号通路，抑制p38MAPK磷酸化进而抑制H1N1病毒介导的肺损伤[16]。本文研究结果显示，DG可促进PPARγ表达，抑制磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase, p-p38MAPK)/p38MAPK表达，推测其可能通过激活PPARγ,抑制p38MAPK表达改善肺结核大鼠的肺损伤。GW9662属于PPARγ特异性拮抗剂，对肺结核大鼠进行GW9662处理，发现PPARγ表达下调，p-p38MAPK/p38MAPK表达上调，说明DG可通过激活PPARγ/p38MAPK通路改善肺结核大鼠的肺损伤。

图5 各组肺结核大鼠肺组织PPARγ、p-p38MAPK/p38MAPK表达比较

综上所述，DG可改善肺结核大鼠的肺损伤，其作用机制与激活PPARγ/p38MAPK通路激活有关。本研究仍存在不足之处，DG调控PARγ/p38MAPK通路机制尚不明确，还需进一步验证。

参考文献:

[3]方辰,张剑锋,张伟,等.甘草酸二铵对百草枯诱导肺泡上皮细胞Toll样受体4的影响[J].中华急诊医学杂志,2019,28:478-483.

[4]黄欢,韩晓群,邓琴,等.二甲双胍基于PPARγ/p38MAPK通路抑制结核分枝杆菌感染巨噬细胞的炎症反应[J].免疫学杂志,2023,39:493-499.

[5]沈凌筠,李莉,王戈,等.大蒜素调控JAK2/STAT3通路对肺结核大鼠肺部炎症影响的研究[J].中国药师,2022,25:561-566.

[6]赵娜,殷莉,秦晓楠.基于白细胞介素13/信号传导和转录激活因子6信号通路研究甘草酸二铵对慢性阻塞性肺疾病大鼠气管黏液高分泌的影响[J].安徽医药,2022,26:1406-1410.

[7]曹亮,张长洪,项保利.参麦注射液通过PPARγ途径改善COPD大鼠炎症及氧化应激状态的实验研究[J].中药药理与临床,2019,35:2-6.

[9]方妮,周鸿江,陈俊健.甘草酸二铵对稳定期慢性阻塞性肺疾病的临床疗效及对患者血清炎性因子和外周血T淋巴细胞水平的影响[J].中国医药,2019,14:1326-1330.d

[10]韦永孜,黄丽静,吴波霖,等.甘草酸二铵在肺结核抗结核引起的药物性肝损伤中的应用观察[J].黑龙江医药,2021,34:12-14.

[11]吴海燕,林娟娟,戢晴,等.基于JAK2/STAT3信号通路探究调控miRNA-27a对肺结核大鼠的干预效果[J].中国现代医生,2023,61:6-10.

[12]童晓维,肖韩.miR-223抑制肺结核大鼠肺部病变[J].基础医学与临床,2022,42:1225-1229.