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ITP患者外周血Tph细胞比例及亚群分析

2024-10-08 19 上传者：管理员

摘要：目的:观察免疫性血小板减少症（ITP）患者外周辅助T（Tph）细胞比例及其亚群分布情况,探讨ITP的发病机制。方法:选取2022年1月至2022年12月于大连医科大学附属第二医院就诊的25例ITP患者及25例性别年龄匹配的健康人作为对照通过流式细胞术分析外周血CD4+T细胞亚群、Tph细胞比例及其亚群分布情况。结果:ITP患者外周血CD4+T细胞中效应记忆T细胞比例明显高于健康对照组（P <0.05）;ITP患者的Tph细胞比例亦明显高于健康对照组（P <0.001）且ITP患者Tph细胞大部分为效应记忆T细胞;Tph细胞与Tfh细胞一样表达共刺激分子ICOS和CD84;Tph细胞主要为Tph2亚型,但与健康对照组相比,ITP患者Tph1型细胞比例明显升高（P<0.05）。结论:ITP患者外周血中Tph细胞比例明显升高,尤其是Tph1型细胞比例明显高于健康对照组,Tph细胞的异常可能为ITP的发病机制之一。

关键词：
CD4+T细胞
ITP
免疫性血小板减少症
外周辅助T细胞
自身免疫性出血性疾病
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免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)是一种自身免疫性出血性疾病。发病机制复杂，研究表明，患者体内存在异常活化的T细胞可作用于自身反应性B细胞产生抗血小板抗体，进而导致血小板破坏过多，生成减少[1-3]。因此CD4+T细胞被认为在ITP发病中发挥着核心作用。CD4+T淋巴细胞是一群复杂的具有明显异质性的淋巴细胞群，其中位于次级淋巴器官生发中心的滤泡辅助T细胞(follicular helper T cells,Tfh)对初始B细胞分化为记忆性细胞或浆细胞起着最关键的作用[4-5]。Tfh细胞特征性表达CXCR5和转录因子Bcl-6，也高表达PD-1、ICOS和CD40L等共刺激分子，通常将CD4+CXCR5+PD-1+或CD4+CXCR5+ICOS+T细胞定义为Tfh细胞[6-7]。

近年来文献报道，在一些自身免疫病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等患者外周血及炎症部位(非淋巴结)中存在大量的CD4+PD1+CXCR5-T细胞，其不表达Bcl-6，但此群细胞亦分泌IL-21、CX-CL13等细胞因子，称之为外周辅助T细胞(peripheral helper T cells,Tph)，此群细胞与患者抗体滴度相关，并与疾病的严重程度呈正相关[8-10]。CX-CR5-Tph细胞同样可以辅助B细胞产生抗体，介导疾病的发生，且其在不同疾病、不同部位可能会适应性地表达不同的有助于T-B细胞相互作用的免疫分子。ITP患者CD4+T细胞异常活化，但ITP中有关Tph细胞的研究甚少。本研究通过分析初发ITP患者外周血CD4+T细胞亚群，探究ITP的发病机制。

一、材料和方法

病例资料

选取2022年1月至2022年12月于大连医科大学附属第二医院就诊的25例ITP患者，其中男性9例，女性16例，中位年龄47(16-89)岁，血小板数(1-28)×109/L。诊断标准根据《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国指南(2020年版)》[11]，排除因结缔组织病、甲状腺疾病、病毒感染、药物因素所致的继发性血小板减少。为避免药物的影响，入组患者均为初发患者，未应用任何ITP相关治疗药物。同时在本院体检中心选取25名性别、年龄相匹配的健康体检者作为对照(healthy control,HC)。本研究得到大连医科大学附属第二医院伦理委员会批准，所有参与者均签署知情同意书。

试剂与仪器

淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司;抗人CD4-FITC、CD4-Per CP-Cy5.5、CCR7-PE、CD45RO-APC-Cy7、PD-1-PE-Cy7、CXCR5-APC、CXCR5-FITC、ICOS-FITC、CD40L-PE、CD84-APC、CCR6-APC、CXCR3-PE单克隆抗体购自美国Bio Legend公司和美国e Bioscience公司;流式细胞仪(Novo Cyte2060R)为美国安捷伦公司产品。

外周血单个核细胞的分离

将ITP患者及健康对照者EDTA抗凝血2 ml与等体积PBS混匀，15 ml离心管内加入淋巴细胞分离液，将PBS稀后的静脉血沿着倾斜的15 ml离心管壁慢慢加到淋巴细胞分离液上层，两者比例为1∶1,800×g离心20 min，提取白膜层，即外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。

细胞表面分子检测

将PBMC收集于流式管中，加入预冷的PBS洗涤2次后，加入100μl流式缓冲液重悬。加入相应的流式抗体，室温避光孵育30 min，用PBS洗涤两次后，加入200μl PBS重悬细胞沉淀，用流式细胞仪进行检测。

统计学分析

采用Graph Pad Prism 9进行统计分析并作图，组内及组间样本比较采用独立样本t检验或配对t检验，数据以mean±SD表示，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

ITP患者外周血中CD4+T细胞中效应记忆T细胞亚群的变化

采用流式细胞术检测ITP患者及HC外周血中CD4+T淋巴细胞的亚群分布，根据CCR7及CD45RO的表达情况，将CD4+T淋巴细胞分为4个亚群:CCR7+CD45RO-初始T细胞(naive T cells,Tn),CCR7+CD45RO+中央记忆T细胞(central memory T cells,Tcm),CCR7-CD45RO-效应T细胞(effector T cells,Teff)和CCR7-CD45RO+效应记忆T细胞(effector memory T cells,Tem)。结果显示，ITP组和HC组外周血CD4+T细胞主要为效应记忆T细胞，且ITP患者效应记忆T细胞亚群比例显著高于HC，差异具有统计学意义[(68.86±4.35)%vs (53.43±4.90)%,P=0.0315](图1)。

ITP患者外周血Tph细胞比例升高

外周血中Tfh及Tph细胞比例的分析结果显示:与HC相比，ITP患者Tfh细胞比例略升高，但差异无统计学意义[(4.81±0.94)%vs (3.21±1.62)%,P=0.1099];而ITP患者中Tph细胞比例明显高于HC，差异有统计学意义[(29.49±1.81)%vs(21.01±1.00)%,P=0.0002](图2A)。进一步分析了Tph细胞表面CCR7及CD45RO的表达情况，结果显示，Tph细胞几乎全部都属于效应记忆T细胞(>90%)(图2B)。

Tph细胞表面共刺激分子表达情况

Tph细胞共刺激分子的检测结果显示，Tph细胞表面亦表达CD84和ICOS，与Tfh细胞比较无差异;Tph细胞CD40L的表达水平明显低于Tfh细胞[ITP:(2.61±0.55)%vs (4.76±0.59)%,P=0.0047];上述分子的表达水平在HC与ITP患者的Tph细胞上无明显差异(图3)。

ITP患者外周Tph1细胞亚群比例升高

根据CXCR3和CCR6的表达情况，可将Tph细胞分为不同的亚群，本研究分析了Tph细胞亚群情况，结果显示，无论是健康对照组还是ITP患者，Tph细胞均以Tph2(CXCR3-CCR6-)亚群为主(>60%);与健康对照组相比，ITP患者Tph1(CXCR3+CCR6-)亚群比例明显升高，差异具有统计学意义[(25.00±2.52)%vs (17.48±2.06)%,P=0.0382](图4)。

三、讨论

ITP是一种自身免疫性疾病，其病理机制复杂，至今仍未完全清楚。抗体包被的血小板通过与Fcγ受体的相互作用在脾脏、肝脏或两者中被破坏，从而导致血小板减少是ITP发病的重要机制之一[12-15]。而抗体反应在很大程度上取决于CD4+T细胞提供的帮助。研究表明，除淋巴结中的Tfh外，在一些自身免疫性疾病患者非淋巴组织中存在的Tph细胞亦同样具有辅助B细胞产生抗体的功能[16-18]。本研究通过流式细胞术分析ITP患者外周血CD4+T细胞亚群，发现ITP中同样存在Tph细胞明显升高。

本研究首先检测了ITP患者外周血CD4+T细胞表面CCR7和CD45RO的表达情况，分析了ITP中CD4+T淋巴细胞亚群的分布，结果显示，ITP患者外周血中效应记忆T细胞(Tem)明显高于健康对照组。效应记忆T细胞主要循环于血液及外周组织中，当机体再次遇到之前感染过的病原微生物时，效应记忆T细胞可以迅速分化为抗原特异的效应T细胞，分泌细胞因子，而且效应记忆T细胞具有更长的寿命[19-20]。

本研究分析了外周血中Tph细胞及Tfh细胞的比例，结果显示，ITP患者中Tfh细胞比例有升高趋势，但与健康对照组无统计学差异，与Yao等[21]报道的ITP中Tfh比例明显升高不一致，有待于增加样本量进一步研究。本研究中ITP患者的Tph细胞比例明显高于健康对照组。本研究进一步分析了Tph细胞中CCR7和CD45RO的表达情况，结果显示，Tph细胞几乎全部为效应记忆T细胞，推测其有更强的免疫反应能力。

依赖于T细胞的体液免疫，需通过细胞粘附、聚集从而相互作用，促进B细胞成熟分化，分泌抗体，且同源T-B细胞之间相互持久的接触是非常重要的，受许多信号的调节，包括CD40L/CD40、ICOS/ICOSL、CD84/CD84[22-23]。其中CD40-CD40L通路是促进抗原特异的B细胞克隆性扩增的必须条件[24]。ICOS-ICOSL介导T-B细胞粘附的信号，在生发中心可以通过旁路途径招募B细胞聚集[25]。CD84信号可以维持持久的T-B细胞相互作用[26]。本研究结果显示，Tph细胞与Tfh细胞一样表达CD84和ICOS。而CD40L在Tph细胞上的表达水平明显低于Tfh细胞，但在两者中的表达比例均较低(<6%)，考虑与CD40L主要表达在活化的T细胞表面有关。

文献报道，CD4+CXCR5-T细胞可以根据CX-CR3和CCR6的表达情况分为不同亚群，其中表达CXCR3的细胞主要为1型细胞，主要分泌IFN-γ;CXCR3-CCR6-主要为2型细胞，分泌IL-4和IL-5;而CXCR3-CCR6+细胞主要分泌IL-17和IL-22等Th17相关的细胞因子[27-28]。CD4+CXCR5-CX-CR3-CCR6-T细胞(即Tph2亚群)可以诱导初始B细胞分化为浆细胞，分泌抗体。而Fortea-Gordo等[16]发现Tph细胞主要的靶细胞为记忆B细胞。本研究结果显示，健康对照组和ITP患者Tph细胞均以Tph2为主，Tph2可以诱导初始B细胞分泌抗体。与健康对照组相比，ITP患者中有更高比例的Tph1,Tph1具有更强的分泌IFN-γ的能力，而IFN-γ亦为ITP的重要致病因素[29]。

本研究对初发ITP患者的Tph细胞进行了初步研究，主要聚焦于其表型的特点，还需要进一步扩大样本量，完善其功能的研究，尤其是对于B细胞作用的研究。

综上所述，本研究结果显示，ITP患者外周血中Tph细胞比例明显升高，且Tph细胞与Tfh细胞一样表达与B细胞作用相关的共刺激分子;Tph细胞主要以Tph2亚群为主，但ITP中的Tph1亚群比健康对照组高。进一步深入探讨Tph细胞功能及生物学特性，将有助于深入了解ITP的发病机制，为临床治疗提供可能的靶点。

参考文献:

11中华医学会血液学分会血栓与止血学组.成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国指南(2020年版).中华血液学杂志,2020,41(8):617-623.

基金资助:辽宁省自然基金面上项目(2021-MS-285);

文章来源:李伟平,白自然,田渝琴,等.ITP患者外周血Tph细胞比例及亚群分析[J].中国实验血液学杂志,2024,32(05):1518-1523.