首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 特种医学论文 > 放射医学论文 > 靶向沉默Ku80对T-ALL细胞系Jurkat化疗敏感性影响的初步研究

靶向沉默Ku80对T-ALL细胞系Jurkat化疗敏感性影响的初步研究

2024-12-02 57 上传者：管理员

摘要：目的:探讨靶向沉默Ku80对T-ALL细胞系Jurkat化疗敏感性的影响以及潜在机制。方法:通过RT-qPCR及Western blot技术检测6种不同血液肿瘤细胞系中Ku80基因的转录与表达水平；设计并构建Ku80特异性shRNA干扰质粒并转染T-ALL细胞系Jurkat后检测Ku80蛋白表达；CCK-8技术检测Ku80沉默后Jurkat细胞的增殖能力；软琼脂克隆形成技术、流式细胞术及Western blot技术分别检测Ku80沉默协同化疗药物依托泊苷(VP16)处理细胞4 h后Jurkat细胞的克隆形成能力、凋亡水平及DNA损伤蛋白γH2AX的表达水平。结果:在选取的6种不同血液肿瘤细胞系中，T-ALL细胞系Jurkat中Ku80的mRNA及蛋白水平均最高。构建的shRNA质粒成功靶向沉默了Jurkat细胞中Ku80的表达。Ku80靶向沉默后Jurkat细胞增殖能力明显下降(P<0.05);VP16孵育前后，Ku80靶向沉默均可显著降低Jurkat细胞克隆形成能力(P<0.01)、提高Jurkat细胞凋亡水平(P<0.01),并且γH2AX的表达水平显著提高(P<0.05)。结论:靶向沉默Ku80表达可增强T-ALL细胞系Jurkat对化疗药物VP16的敏感性，这或与其造成的DNA损伤积累水平增加有关。

关键词：
DNA损伤反应
Jurkat细胞
Ku80
依托泊苷
血液系统
加入收藏

急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)是一组起源于T淋巴细胞的血液系统恶性肿瘤，在儿童及成人急性淋巴细胞白血病(ALL)中的占比分别为10%-15%和25%[1]。尽管随着治疗方案的不断精进，初治T-ALL患者的5年无病生存率可达85%[2-6],但T-ALL患者仍存在疾病复发表现，复发患者的预后极差，生存率降至25%以下[7]。因此，寻找可以增强T-ALL化疗敏感性的治疗靶点成为了提高治疗效果的关键。既往研究证实，DNA损伤修复能力的增强是恶性肿瘤细胞产生化疗耐受性的主要原因之一。因此，抑制DNA损伤修复途径或可为提升T-ALL细胞对化疗药物的敏感性提供新策略。

Ku80蛋白(又称Ku86)可在哺乳动物细胞中与Ku70蛋白形成异二聚体，共同参与DNA损伤修复、V(D)J重排及维护端粒稳定性等多种生物学活动[8-10]。既往研究显示，Ku蛋白与肺癌、直肠癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤演进有关，并与卵巢癌对铂类药物耐受性相关[11-15]。然而，Ku80对T-ALL细胞化疗敏感性的影响当前仍鲜有研究。本文旨在初步探究靶向沉默Ku80对T-ALL细胞系Jurkat的化疗敏感性的影响，以期为T-ALL的治疗提供新的思路。

1、材料和方法

试剂与仪器

Jurkat细胞系(人白血病T淋巴细胞)、K562细胞系(人慢性髓系白血病细胞)、Raji细胞系(人Burkitt’s淋巴瘤细胞)、THP-1细胞系(人单核细胞白血病细胞)、CAM191细胞系(人正常淋巴细胞)及293T/17细胞系(人胚胎肾细胞)均购自中国科学院细胞库，Karpas299及Su-DHL-1细胞系(人间变性大细胞淋巴瘤细胞)均购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ),本实验室长期保存的细胞株。RPMI-1640、IMDM、DMEM培养基及胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)均购自美国Gibco公司。依托泊苷(etoposide, VP16)购自美国Selleck公司。RNA提取、逆转录及qPCR定量试剂盒(MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScript RT Master MIX及TB Green Premix Ex TaqTMII),均购自日本Takara公司。RIPA蛋白裂解液购自美国Thermo-Scientific公司。蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂均购自中国雅酶Epizyme公司。BCA蛋白定量试剂盒购自中国碧云天Beyotime公司。兔抗人Ku80抗体、pSer139 H2AX(γH2AX)抗体均购自美国CST公司。pLVX-shRNA质粒骨架购自美国Clontech实验室。细胞高效磷酸钙钙转染试剂盒购自中国Biowit公司。CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司。低熔点琼脂糖购自美国Thermo-Scientific公司。细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD Pharmingen公司。细胞培养箱购自美国Thermo-Scientific公司。qPCR仪为瑞士罗氏公司产品。酶标检测仪购自美国Molecular Devices公司。流式细胞检测仪为美国BD Bioscie-nce公司产品。

RNA提取及qPCR

收集处于对数生长期的细胞并通过相应试剂盒提取总RNA,逆转录为cDNA后进行qPCR检测。相关引物序列如表1。目的基因mRNA相对定量采用2-ΔΔCT法进行。

shRNA质粒构建与细胞转染

参考相应文献设计并合成Ku80基因的shRNA序列，同时设计与人类基因组不同源的无关序列作为对照组(记为NC或shNC)(表2)。将对数生长期的293T/17细胞接种于10 cm培养皿中，并按照Clontech公司说明，将构建完成的pLVX-shRNA质粒和pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.2dvpr质粒共同通过磷酸钙转染法转染293T/17细胞并分别于48及72 h后收集含慢病毒的细胞上清液。随后以收集所得的慢病毒液感染Jurkat细胞，孵育24 h后收集成功转染的Jurkat细胞进行后续实验。

VP16孵育细胞

收集处于对数生长期的细胞以PBS清洗后将细胞浓度稀释为105/ml并接种至6孔板内。以1∶1 000的体积加入VP16,使其终浓度为5μmol/L,并同时设置阴性对照组。细胞于37℃培养箱内孵育4 h后以PBS洗脱药物并继续孵育48 h后收集细胞进行后续实验。

Western blot检测蛋白表达

收集相应细胞样本并加入RIPA(含蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂)充分裂解细胞，提取细胞蛋白后使用BCA试剂进行定量。将蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后通过恒定电流转膜法转至PVDF膜上。以5%浓度的脱脂牛奶封闭PVDF膜。按照目标蛋白大小裁剪条带后分别与对应的一抗(稀释比例参照说明书)于4℃中孵育过夜；与对应二抗(稀释比例为1∶2 000)室温孵育2 h后，通过ECL化学发光显色液进行曝光显影。最终以Image J软件分析并计算目的蛋白条带灰度值。

CCK-8实验检测细胞增殖能力

收集对数生长期的细胞以PBS清洗后稀释为104/ml。以100μl/孔接种于96孔板内，即每孔细胞1 000个，同时重复铺3块96孔板。将所有96孔板均置于细胞培养箱内连续孵育3 d。每一日取出一块96孔板，向各孔内避光加入10μl CCK-8试剂后继续孵育2 h,以酶标仪探测OD450并以此数值绘制曲线，即为细胞增殖曲线。

软琼脂克隆形成实验检测克隆形成能力

分别配置浓度为0.6%(琼脂A)及0.3%(琼脂B)的软琼脂液并高温高压灭菌后备用。向24孔板内每孔加入200μl琼脂A,注意不要产生气泡。于4℃冷却15 min待软琼脂完全凝固。收集对数生长期的细胞并稀释至105/ml后按照1∶100的比例与软琼脂B充分混合均匀后向24孔板内每孔加入200μl(即200个细胞/孔)。将24孔板置于37℃培养箱内孵育30 min后置于4℃中冷却15 min。最终将培养板置于37℃培养箱内孵育10 d。期间每2 d向各孔加入100μl新鲜培液以免软琼脂干裂或细胞营养不足。最终于显微镜下观察并记录各组细胞的克隆形成大小与数量。

流式细胞术检测凋亡水平

收集各组处于对数生长期的细胞并以PBS清洗后，以1×Binding Buffer重悬细胞并将其浓度稀释至1-5×106/ml。将细胞悬液分为100μL每组，并向其中分别加入Annexin V或(和)PI染色剂。轻弹混匀后置于室温下避光孵育15-20 min。结束孵育后向各管细胞内加入400μL 1×Binding Buffer并轻柔吹打混匀后与1小时内进行上机检测。

统计学分析

采用SPSS 19软件进行数据分析，以Graphpad Prism 7.0软件绘图。计量数据以平均值±标准差表示。各项实验均进行3次独立重复实验，数据分析采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

Ku80在不同血液系统恶性肿瘤细胞系中的表达情况

以正常人淋巴细胞系CAM191为对照组，通过qPCR实验探究多种血液系统恶性肿瘤细胞系中Ku80的转录水平。结果显示，相比于正常淋巴细胞系，血液系统恶性肿瘤细胞系中Ku80转录水平均明显升高，并且在Jurkat细胞中Ku80mRNA水平最高(图1A)。进一步的Western blot实验同样证实Ku80蛋白表达水平在Jurkat细胞系中最高(图1B-C)。因此，本研究选取Jurkat细胞系进行后续实验，以期更明确探讨Ku80在血液系统恶性肿瘤中的作用。

shRNA介导的Ku80靶向沉默对Jurkat细胞增殖能力的影响

Western blot实验检测各组细胞中Ku80蛋白的表达情况，结果显示，以pLVX-shRNA空载骨架(sh- Vector)及连接有非人类基因组同源序列的shRNA质粒(sh-Negative Control, shNC)做为对照组，实验组(sh-Knockdown, shKD)中Ku80表达水平显著降低(图2A)。由此证实该组shRNA质粒可明显沉默Ku80基因表达。

CCK-8实验探究Ku80靶向沉默前后对Jurkat细胞增殖能力的影响。结果显示，在细胞培养1、2和3 d时，Ku80沉默均有效抑制了Jurkat的增殖(图2B)。

Ku80靶向沉默对Jurkat细胞VP16敏感性的影响

我们通过软琼脂克隆形成实验探究VP16孵育前后，靶向沉默Ku80表达对Jurkat细胞克隆形成能力的影响(图3A-B)。结果显示，VP16孵育前后，Ku80的靶向沉默均可有效降低Jurkat细胞的克隆形成能力，表现为克隆大小、数目的明显减低。进一步的流式细胞术检测结果显示，无论是否予以VP16,Ku80沉默均可明显提高Jurkat细胞的凋亡水平(图3C-D),并且联合Ku80沉默及VP16时Jurkat细胞的克隆形成能力最低，凋亡水平最高。因此，靶向沉默Ku80可显著提高Jurkat细胞对VP16的化疗敏感性。

Ku80靶向沉默联合VP16前后对Jurkat细胞γH2AX蛋白表达的影响

γH2AX是目前公认的DNA双链损伤(double strain break, DSB)的标志性蛋白。通过Western blot实验证实，相比于对照组，Ku80沉默可显著提高VP16造成的DSB积累。而未进行VP16孵育时，抑制Ku80表达也可提高Jurkat细胞内的γH2AX表达(图4)。以上结果证实，Ku80沉默可促进细胞内DSB水平积累。而Ku80沉默可增强Jurkat细胞对VP16敏感性的现象或与其可提高细胞内DSB水平相关。

3、讨论

T-ALL是一组起源于T淋巴细胞的血液系统恶性肿瘤。尽管近年来随着各类化疗药物的衍生，T-ALL的预后得到了大幅改善，但仍有部分患者对现有的药物表现出耐受性。既往研究证实，DNA损伤应答(DDR)机制在肿瘤细胞的化疗耐受性中起到了重要作用[16-18]。因此，通过靶向抑制与该通路密切相关的蛋白或可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

Ku蛋白是由Ku70(70 KDa)及Ku80(80 KDa)所构成的一种异二聚体蛋白质复合物，广泛参与细胞内的多种生物学过程，例如维持端粒、调控基因转录、参与DNA损伤修复、调控热休克反应及凋亡等[19]。有学者认为，Ku蛋白参与维持端粒稳定性，调控细胞DNA损伤修复，有助于维持基因组完整、稳定，是一种抑癌基因[20-22]。然而，越来越多的研究显示肿瘤的演进与其DNA修复能力、端粒稳定性之间也存在密切关系。因此，也有学者认为Ku蛋白是一种原癌基因。Ku80蛋白作为Ku蛋白的组成之一，其功能的缺失可促使P53基因活化，使细胞生长受限并走向凋亡[23]。既往研究显示急性白血病中，Ku蛋白表达相较于正常人明显提高[24]。然而Ku蛋白在血液系统恶性肿瘤演进、化疗敏感性等方面的作用仍有待进一步探索。本研究通过构建Ku80靶向沉默质粒并转染T-ALL细胞系Jurkat细胞，成功下调该细胞中Ku80的表达。Ku80靶向沉默后，Jurkat细胞增殖能力明显下降，揭示了Ku80在T-ALL细胞生长中的关键作用，靶向沉默Ku80或可为T-ALL的治疗提供新思路。

DNA损伤可大致分为DNA单链断裂(single strand breaks, SSBs)及DNA双链断裂(DSBs)两大类。其中，DSBs作为致命性损伤，在真核细胞生物体内主要通过同源重组(homologous recombination, HR)或非同源性末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)途径进行修复[25-26]。依托泊苷(etoposide, VP16)为一种经典的DNA拓扑异构酶II(TopoII)抑制剂，通过干扰TopoII催化集团，形成VP16-TopoII-DNA复合物，从而阻止TopoII对受损DNA的修复，促进DSBs的产生与积累[27]。目前，VP16被广泛应用于小细胞肺癌、胃癌、恶性淋巴瘤、白血病等多种恶性肿瘤的治疗中。当VP16诱导细胞产生DSBs时，Ku70/Ku80二聚体能够迅速识别并结合至细胞内DSB的末端，进而招募并激活DNA-PKc,启动NHEJ修复通路，使肿瘤细胞对相应的DNA损伤性化疗药物产生耐受性。既往研究显示，在多种恶性肿瘤中，Ku80的下调或缺失显著增强了细胞对放疗、化疗或靶向治疗的敏感性[15,28-29]。本研究结果显示，靶向沉默Ku80能够导致Jurkat细胞内DSBs的标志性蛋白γ-H2AX表达水平增高，这表明DSBs的积累增加，从而Jurkat细胞的凋亡水平提高，增殖能力受到抑制。同时，当联合应用VP16及Ku80靶向沉默时，细胞内γ-H2AX蛋白的积累达到最高水平，克隆形成能力最低，凋亡水平最高。在未来的研究中，我们或将进一步通过细胞周期分析、Ku80过表达实验等，更深入地探讨Ku80靶向沉默对Jurkat细胞系化疗敏感性的影响机制，并通过裸鼠皮下成瘤实验或构建T-ALL小鼠模型，在体内实验领域进一步验证Ku80靶向抑制对T-ALL细胞化疗敏感性的提升作用。

综上所述，靶向沉默Ku80可促进VP16造成的DSBs积累，显著提高Jurkat细胞对VP16的化疗敏感性，为T-ALL的治疗提供了新思路，并为后续探究白血病患者的潜在治疗方案奠定了基础。

参考文献:

18徐莉,唐海龙,龚雪,等.西达本胺诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡及与DNA损伤反应的相关性.中国实验血液学杂志,2015,24(2):450-454

21史晋洁,王鹰,苏延倩,等.慢性粒细胞白血病患者血清COX-2､bFGF､TGFβ1及VEGF表达水平与疾病严重程度的关系.临床血液学杂志,2021,34(12):860-863.

24王苏亮,包晓琳,魏金龙,等.Ku蛋白质在急､慢性骨髓系白血病的表达及其意义.系统医学,2022,7(21):37-41.

基金资助:国家自然科学基金重点项目(81830004);

文章来源:范卓异,梁爱斌.靶向沉默Ku80对T-ALL细胞系Jurkat化疗敏感性影响的初步研究[J].中国实验血液学杂志,2024,32(06):1689-1695.