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艾绒总黄酮提取工艺优化及其抗氧化活性研究

2024-10-26 14 上传者：管理员

摘要：目的确定最佳的超声波提取艾绒中总黄酮的方法以及所得提取液的抗氧化活性。方法首先，通过单因素实验和正交实验优化艾绒中总黄酮的提取工艺；其次，通过所得提取液对DPPH·和·OH的清除实验评价其抗氧化能力。结果超声波辅助提取艾绒中总黄酮的最佳条件为：料液比为1∶60（g∶m L）、提取温度为50℃、超声时间为60min、乙醇浓度为50%。在此工艺下，艾绒中总黄酮的平均提取率为4.30%,RSD为0.40%。抗氧化实验结果表明，艾绒总黄酮提取液对DPPH·和·OH的IC50（半清除浓度）值分别为90.39μg·m L-1和185.51μg·m L-1，表明艾绒总黄酮提取液具有一定的抗氧化能力。结论该提取工艺操作简便，重复性良好，所得的提取液具有抗氧化活性，为艾绒资源的开发和使用提供指导。

关键词：
总黄酮
抗氧化活性
正交实验
艾绒
超声波
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艾绒是干燥的艾叶经人工碾压或机械粉碎，过筛后所得到的软细如棉的绒状物。艾绒为灸用制品的原材料，具有温通经脉、调和气血、散寒止痛等作用[1-3]，从艾绒中分离出来的主要化学成分有挥发油、总黄酮等[4,5]。有机溶剂浸提法、超临界萃取法、超声波和微波辅助提取等[6-11]方法都可用于黄酮类化合物的提取，其中超声波辅助提取法因具有高效、省时、低成本等优点而被广泛应用。本实验旨在优化艾绒中总黄酮的提取工艺，并通过体外抗氧化实验研究提取物的抗氧化活性，为艾绒资源在保健品生产中的进一步标准化和应用提供指导。

1、实验部分

1.1材料、试剂及仪器

艾绒（南阳市仲景商贸城）；芦丁标准品（纯度≥98%上海源叶生物科技有限公司）；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·纯度≥97%国药集团化学试剂有限公司）；L-抗坏血酸（AR上海伯奥生物科技有限公司）；无水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、FeCl2、H2O2、水杨酸，均为分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司。

722型分光光度计（上海第三分析仪器厂）；数控型超声波清洗仪（河南省引领仪器设备有限公司）；电子天平（上海菁海仪器有限公司）。

1.2实验方法

1.2.1总黄酮含量的测定

1.2.1. 1供试品溶液制备

称取干燥的艾绒试样1.00g（精确至0.1mg）置于150mL具塞锥形瓶中，首先加入适量体积、适当浓度乙醇溶液，然后在合适的提取温度下经过超声处理一定时间，超声波辅助提取功率为200W。将经超声波处理得到的总黄酮提取液移至250mL容量瓶中，加特定浓度的乙醇溶液至刻度，摇匀备用。

1.2.1. 2标准曲线的建立[12]

精密吸取1mL芦丁标准品溶液（0.2mg·mL-1）置于10mL容量瓶中，加入乙醇溶液（2+3）至总体积为2mL，依次加入0.3mL NaNO2溶液（50g·L-1）、0.3mL Al(NO3)3溶液（100g·L-1）、2m L NaOH溶液（1mol·L-1）（每加一种溶液都要摇匀，并且间隔6min后再进行下一步操作），最后用乙醇溶液（2+3）定容至刻度，摇匀，备用。静置15min后，装入1cm比色皿中，以试剂空白溶液为参比溶液，在波长470～530nm范围内测定该溶液吸光度；以波长为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制吸收曲线。

分别精密吸取0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL芦丁对照品溶液（0.2mg·mL-1）于6个10mL容量瓶中，按照最大吸收波长的操作步骤，从“加入乙醇溶液（2+3）至总体积为2mL”开始，至“静置15min”止。

1.2.1. 3艾绒提取液中总黄酮的测定

将经超声处理的供试品溶液干过滤，弃去最初50mL滤液，准确吸取1.0mL滤液于10mL容量瓶中，按照最大吸收波长的操作步骤，从“加入乙醇溶液（2+3）至总体积为2m L”开始，至“静置15min”止；然后测定待测溶液的吸光度值，根据标准曲线计算待测溶液中总黄酮的质量浓度（mg·mL-1），试样中总黄酮提取率（%）按照式（1）计算：

式中W：艾绒试样中总黄酮的提取率，%；C：由标准曲线计算得到的总黄酮的质量浓度，mg·m L-1;V：待测溶液的体积，10mL;N：稀释比例，1/250;M：艾绒试样质量，g。

1.2.2单因素实验

通过讨论料液比（A）、提取温度（B）、超声时间（C）、乙醇浓度（D）对超声波辅助提取艾绒中总黄酮影响的单因素实验，选择各个因素种类中对总黄酮提取影响显著的水平值。

在以下水平下改变变量：料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)(g∶mL），提取温度（30、40、50、60、70℃），超声时间（20、40、60、80、100min），乙醇浓度（20%、30%、40%、50%、60%）。当考察一个变量时，其他变量固定在上述范围的中值水平，对艾绒中的总黄酮进行提取，定容，测定其吸光度值，分别计算总黄酮提取率。

1.2.3正交实验

采用L9(34）正交实验设计,考察料液比（A）、提取温度（B）、超声时间（C）、乙醇浓度（D）四因素三水平（表1）对总黄酮提取率的影响，通过9次实验结果确定最佳提取工艺。

表1正交实验因素水平表

1.2.4抗氧化活性的测定

1.2.4. 1 DPPH·清除实验[13]

最佳工艺提取液配制成质量浓度为20、40、80、120、160、200μg·mL-1的艾绒总黄酮溶液，准确吸取不同质量浓度的艾绒总黄酮溶液1.0mL分别置于10mL比色管中，分别加入5.0mL的DPPH·乙醇溶液（0.06mg·mL-1），充分混匀，避光放置30min，于517nm处测吸光度A样品，用等浓度的L-抗坏血酸作阳性对照，计算公式如下：

式中A样品：1.0mL样品溶液+5.0mL DPPH·溶液的吸光度；A底液：1.0mL样品溶液+5.0mL无水乙醇的吸光度；A空白：1.0mL无水乙醇+5.0mL DPPH·溶液的吸光度。

1.2.4. 2·OH清除实验[14]

准备系列25mL比色管，依次加入3.0mL FeCl2溶液（5mmol·L-1),3.0mL不同质量浓度的艾绒总黄酮溶液，3.0mL H2O2溶液（5mmol·L-1），充分混匀后，静置10min；再加入3.0mL水杨酸乙醇溶液（5mmol·L-1），再次混匀，在37℃水浴锅中静置30min，于510nm处测吸光度A1，用等浓度的L-抗坏血酸作阳性对照，计算公式如下：

式中A0:3.0mL Fe Cl2溶液+3.0mL蒸馏水+3.0mL H2O2溶液+3.0mL水杨酸乙醇溶液的吸光度；A1:3.0mL FeCl2溶液+3.0mL样品溶液+3.0mL H2O2溶液+3.0mL水杨酸乙醇溶液的吸光度；A2:3.0mL FeCl2溶液+3.0mL样品溶液+3.0mL蒸馏水+3.0mL水杨酸乙醇溶液的吸光度。

1.2.5统计分析

采用EXCEL 2007软件进行数据的基本分析，运用SPSS 26.0软件回归拟合自由基清除率随浓度变化的曲线，计算IC50（半清除浓度）值。

2、结果与讨论

2.1标准曲线的绘制

图1吸光度-波长曲线

由图1可见，在波长470～530nm范围内，含有1.0mL芦丁对照品溶液（0.2mg·mL-1）的吸光度随着波长的增加先增大后减小，在510nm处的吸光度最大，故选择510nm为最佳吸收波长。在此波长下测定芦丁标准曲线溶液（1.2.1.2）的吸光度，以试剂空白溶液为参比溶液；以芦丁对照品的质量浓度C为x轴对吸光度A为y轴绘制标准曲线。见图2。

图2标准曲线

由图2可见，芦丁对照品的质量浓度与其吸光度的关系符合郎伯-比尔定律，线性回归方程为：y=18.493x+0.0005,R2=0.9998；该方程的线性关系较好，其中线性工作浓度范围为0～0.04mg·mL-1。

2.2单因素实验

图3各因素对总黄酮提取率的影响

由图3(a)可见，艾绒中总黄酮的提取率在料液比为1∶20～1∶60(g∶mL）区间内随着料液比值的减小先增大后逐渐稳定。这可能是由于随着乙醇溶液用量的增加，溶液与艾绒充分接触，促进了艾绒中黄酮类化合物的溶出；当料液比达到1∶50(g∶mL）后，艾绒中的黄酮类化合物已经完全溶出，总黄酮提取率几乎不再变化，因此，选取料液比为1∶40、1∶50、1∶60(g∶mL）进行正交实验。

由图3(b）可见，艾绒中总黄酮提取率在提取温度为30～70℃范围内呈现先增大后减少的趋势，在50℃时达到峰值。这可能是由于温度的增加能促使溶剂分子向艾绒分子中的扩散增强，有助于黄酮类化合物的溶出；但过高的温度又会造成一些不稳固的黄酮类化合物的组织结构发生异变[15]，导致总黄酮提取率降低，因而选择提取温度为40、50、60℃进一步实验。

由图3(c）可见，艾绒中总黄酮提取率在超声时间为20～100min范围内呈现先迅速增大后缓慢减少的趋势，在60min时出现拐点。这可能是由于短时间（60min以内）不足以完全溶解和提取黄酮类化合物；当时间超过60min时，部分黄酮类化合物结构会遭到破坏，致使总黄酮提取率下降[7]，因此，选择超声时间为40、60、80min进行正交实验。

由图3(d）可见，艾绒中总黄酮的提取率在乙醇浓度为20%～60%范围内呈现先增大后减少的趋势，在乙醇浓度为50%时出现最大值。这可能是由于随着乙醇浓度的增加，溶剂的渗透性逐渐增大，促进黄酮类化合物的溶出；但乙醇浓度过高，溶液的极性反而降低，使得亲水性黄酮类化合物的溶解度降低，故选择乙醇浓度为30%、40%、50%进一步实验。

2.3正交实验

表2正交实验结果

通过比较表2中极差R值可知，料液比（A）、提取温度（B）、超声时间（C）、乙醇浓度（D）对艾绒中总黄酮提取率影响的强弱次序为：乙醇浓度（D）>料液比（A）>提取温度（B）>超声时间（C）；每列k值的最大值所对应的水平，即为该因素的最优水平，可得最佳工艺组合为A3B2C2D3，即超声波辅助提取艾绒中总黄酮的最佳提取条件为：料液比1∶60(g∶mL），提取温度50℃，超声时间60min，乙醇浓度50%。

2.4最佳工艺验证

称取5份干燥的艾绒试样各1.00g（精确至0.1mg），在最佳工艺组合A3B2C2D3下进行5次平行验证性实验，测定艾绒中总黄酮提取率，结果见表3。

表3最佳工艺验证结果

在最佳提取工艺条件下，即料液比为1∶60(g∶mL）、提取温度为50℃、超声时间为60min、乙醇浓度为50%的条件下，艾绒中总黄酮平均提取率为4.30%,RSD值为0.40%，说明正交实验优化超声波辅助提取艾绒中总黄酮的工艺重复性良好，稳定可行。

2.5艾绒总黄酮抗氧化活性研究

2.5.1清除DPPH·能力

图4艾绒总黄酮提取液对DPPH·自由基的清除能力

由图4可见，提取液在20～160μg·mL-1浓度范围内时，DPPH·清除率与艾绒总黄酮提取液浓度几乎呈线性关系；提取液浓度大于160μg·mL-1时，清除率依然增大，但线性坡度趋于平缓；当提取液浓度为200μg·mL-1，对应的清除率为93.3%。在20～200μg·mL-1浓度范围内，L-抗坏血酸对DPPH·的清除率先迅速增加后趋于稳定；浓度为80μg·m L-1时，清除率达到最大值96.3%。艾绒总黄酮溶液和L-抗坏血酸均有较强的清除DPPH·能力，艾绒总黄酮的IC50为90.39μg·mL-1,L-抗坏血酸的IC50为27.73μg·mL-1，艾绒总黄酮提取液对DPPH·的清除能力是L-抗坏血酸清除能力的0.31倍。

2.5.2清除·OH能力

图5以浓度依赖的方式显示了艾绒总黄酮提取液和L-抗坏血酸的·OH清除活性。

图5艾绒总黄酮提取液对·OH自由基的清除能力

由图5可见，在浓度为20μg·mL-1时，艾绒总黄酮提取液和L-抗坏血酸对·OH的清除率分别为7.8%和28.3%，在浓度为200μg·m L-1时，对应的·OH清除率分别为51.2%和91.6%；艾绒总黄酮溶液对·OH的清除能力要弱于L-抗坏血酸的清除能力，艾绒总黄酮的IC50为185.51μg·mL-1,L-抗坏血酸的IC50为45.18μg·mL-1，艾绒总黄酮提取液对·OH的清除能力是L-抗坏血酸清除能力的0.24倍。

3、结论

本文以艾绒为研究对象，运用超声波辅助提取其中的总黄酮，通过单因素实验和正交实验优化后的提取工艺为：料液比1∶60(g∶mL），提取温度50℃，超声时间60min，乙醇浓度50%，总黄酮平均提取率为4.30%(n=5,RSD值为0.40%）；提取液对DPPH·和·OH的IC50值分别为90.39μg·mL-1和185.51μg·mL-1，表明该提取液具有较强的DPPH·和·OH清除能力。该研究可为艾绒中总黄酮的提取及艾绒作为天然抗氧化剂在保健品领域的开发和利用提供一定的参考价值。

参考文献:

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基金资助:河南省市场监督管理局科技计划项目(HNSCJGK202475);

文章来源:姚恒,党玉东,吴史博,等.艾绒总黄酮提取工艺优化及其抗氧化活性研究[J].化学工程师,2024,38(10):95-99.