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探讨响应面法对巧克力中矿物油超声辅助提取工艺的完善

2020-09-09 238 上传者：管理员

摘要：为探究巧克力中矿物油含量，利用响应面法对巧克力中矿物油超声辅助提取工艺进行优化，得到最佳提取条件为：时间26min，温度35℃，料液比1∶3.2(g/mL），超声功率120W，该条件下矿物油提取量可达（3.127±0.194)mg/kg，与预测值相符。气相色谱检测矿物油时，采用标准曲线和内标结合法对矿物油进行定性定量分析，C9～C40正构烷烃标准工作液在0.32mg/L～200mg/L浓度范围内线性关系良好。该方法检出限为0.26mg/kg，定量限是0.78mg/kg，加标回收率为85.2%～97.4%，相对标准偏差介于0.37%～1.33%之间。运用该方法对市售10种巧克力中的矿物油含量进行提取检测，结果发现样品中均存在矿物油污染的情况，平均含量介于1.047mg/kg～7.073mg/kg之间，该提取检测方法定量准确、操作简单，可用于分析巧克力中的矿物油含量。

关键词：
分析化学
响应面
巧克力
提取
检测
气相色谱
矿物油
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矿物油作为石油的副产物，常被称为白油或者是石蜡油[1]。由于其被人体摄入易在体内富集，所以食用掺有一定量矿物油的食品就会对人体造成危害。食品中矿物油和传统意义上的污染物有所不同，不仅不易挥发而且组成非常复杂，是C10～C50烃类化合物总称，主要分两大类，一类是以多芳香化合物形式存在的芳香烃矿物油，另一类为饱和烃矿物油，其具有支链、直链和环状结构[2,3,4]。其中，致癌和致突变的主要来源是具有4～6环结构的多环芳烃矿物油[5,6,7]。矿物油的毒性和它的黏度已证明存在一定的关系，黏度越高的矿物油毒副作用越不明显，而有非常明显毒害作用的是低黏度矿物油[8,9]。

目前，国际上检测矿物油多采用液相色谱与气相色谱联用，国内刘玲玲等[10]建立了高效液相色谱-气相色谱联用测定稻谷和大米中饱和烃矿物油（MOSH）的方法，但该检测方法仪器昂贵，无法普及。刘亮等[11]采用气相色谱-质谱法检测鸡肉中的矿物油，虽然质谱定量准确，但是矿物油结构复杂，信息不足，难以定量。本文对巧克力中矿物油进行超声辅助提取，并进一步通过响应面法优化，得到最优提取工艺，分离纯化时用硝酸银硅胶固相萃取柱，检测时采用气相色谱（配备氢火焰离子化检测器），该提取检测方法操作简单，定量准确，对试验条件和仪器要求不高，可为后续食品中矿物油的日常提取检测提供理论支持。

1、材料与方法

1.1仪器与试剂

气相色谱仪（GC-7820A，配备氢火焰离子化检测器）：美国Agilent公司；超声波清洗器（SK5200LHC）：上海科导超声仪器有限公司；高速冷冻离心机（KDC-160HR）：安徽中科中佳科学仪器有限公司。

正己烷（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；硅胶（0.063mm～0.200mm）：上海麦克林生化科技有限公司；C7～C40正构烷烃混合标准溶液、环己基环己烷：美国Sigma-Aldrich公司；AgNO3（分析纯）：上海精细化工材料研究所；巧克力：市购。

1.2试验方法

1.2.1标准溶液

10mg/mL内标储备液中准确移取0.5mL于25mL棕色容量瓶内，用正己烷定容，得浓度为200mg/L的内标使用液。

准确移取浓度为1mg/mL的C7～C40正构烷烃混合标准溶液1mL于5mL的棕色容量瓶中定容，得到200mg/L标准工作液；以此方法分别配制200、40、8、1.6mg/L以及0.32mg/L的系列标准工作液[12]。

1.2.2矿物油的提取工艺及优化

准确称取3g切碎的巧克力样品于锥形瓶中，以正己烷为溶剂，加入30μL内标使用液，在超声辅助条件下对样品提取3次，然后将其离心15min（转速8000r/min），取上清液氮吹浓缩至2mL，得样品提取液[13]。

1.2.2.1矿物油提取的单因素试验

根据预试验，分别设定超声辅助提取时间25min、温度30℃、料液比1∶3(g/mL）、功率120W，采用控制变量法考查不同条件下巧克力样品中矿物油提取量的变化。

1.2.2.2响应面优化矿物油提取工艺

在前期的单因素试验结果基础上，选取单因素试验中各最佳因素条件为中间水平，以矿物油提取量为响应值，设计四因素三水平的Box-Behnken试验方案[14]，如表1所示。

表1Box-Behnken试验设计因素与水平

1.2.3样品净化

按文献[15]制备固相萃取柱柱，将玻璃纤维滤纸放入5mL玻璃注射器底部，加入3g0.3%银渍硅胶后敲实，银渍硅胶表面再放一层玻璃纤维滤纸。用10mL正己烷淋洗，弃去流出液，待液面接近填料时，加入1.2.2中的2mL提取液，以15mL正己烷洗脱，弃去最初2mL洗脱液，收集后续10mL，氮吹浓缩至1mL，备用。

1.2.4色谱条件

色谱条件见表2。

1.2.5检出限和定量限

将标准工作液进一步稀释，相同条件下取各低浓度的工作液检测6次，由yd=3.3×σb,yq=10×σb可得检出限和定量限，式中：yd、yq分别为LOD、LOQ处的信号响应值；σb为标准曲线最低浓度点的标准偏差[16]。

表2色谱条件

2、结果与分析

2.1单因素试验结果与分析

2.1.1提取时间对矿物油提取量的影响

提取时间对矿物油提取量的影响见图1。

图1提取时间对矿物油提取量的影响

由图1可知，随提取时间增加，矿物油提取量增加，但当超过25min后，提取量略有减少。主要因为提取时间越长，越有利于巧克力中矿物油扩散至提取液中，达到平衡后继续增加提取时间将会增加体系的不稳定性，导致提取量降低[17]。考虑到实际应用，在后续响应面优化试验中选提取时间为20min～30min。

2.1.2提取温度对矿物油提取量的影响

提取温度对矿物油提取量的影响见图2。

图2提取温度对矿物油提取量的影响

从图2中可以看出，当提取温度未超过30℃时，矿物油提取量随温度升高而快速上升，在此之后温度升高提取量开始下降。虽然温度升高有助于加速分子运动，但是当体系达到平衡后，温度对矿物油提取量的影响不明显，反而会使溶剂挥发且浪费热源，此外高温还可能导致矿物油的挥发，因此将20℃～40℃作为理想的提取温度进行后续优化。

2.1.3料液比对矿物油提取量的影响

料液比对矿物油提取量的影响见图3。

图3料液比对矿物油提取量的影响

根据图3可知，在料液比在1∶1(g/mL)～1∶3(g/mL）范围，矿物油提取量逐步增加，当溶剂体积超过3倍时，提取量略有下降。由于溶剂添加量太少，提取物溶出困难，导致提取量不高；当溶剂添加量过多时，超声空化作用减小；另外溶剂体积过大，造成资源浪费，且后续氮吹浓缩时间变长，导致矿物油损失[18]。由此可见，应将1∶2(g/mL)～1∶4(g/mL）作为理想的料液比范围进行后续响应面优化。

2.1.4超声功率对矿物油提取量的影响

超声功率对矿物油提取量的影响见图4。

图4超声功率对矿物油提取量的影响

由图4中看出，超声功率介于80W～120W之间，矿物油提取量逐步增加，此后提取量呈下降的趋势，可能由于超声有其独特的力学、热学及空化效应等物理化学效应会对矿物油提取量造成一定的影响。因此选择100W～140W作为理想的超声功率范围并进行后续响应面优化。

2.2响应面法优化试验

利用Design-Expert进行试验设计及数据处理，试验结果见表3，拟合表中数据，建立数学模型，得到回归方程为：Y=4.63+0.29A+0.10B+0.40C-0.11AB-0.044AC+0.13AD-0.032D+0.018BC-0.096BD-0.020CD-0.60A2-0.70B2-0.53C2-0.61D2。

表3Box-Behnken试验设计及结果

回归模型方差分析见表4。

由表4可知：模型P<0.0001，失拟项P=0.0588，说明这个二次方程模型极显著，回归模型拟合度好，试验误差小。其中R2=0.9831>0.9，试验模型的校正系数R2Adj=0.9661，说明可以用此模型对巧克力中提取矿物油进行分析和预测。结果表明，该模型中A、D、A2、B2、C2、D2和B、AD对矿物油提取量影响分别达到极显著水平和显著水平[19]。

表4回归模型方差分析表

注：*表示P<0.05，差异显著；**表示P<0.01，差异极显著。

各因素交互作用对矿物油提取量的响应面图见图5。

由图5及F值大小得各因素对矿物油提取量影响主次顺序为料液比>提取时间>提取温度>超声功率。以试验模型预测时间、温度、料液比和超声功率最佳条件分别为：26.125min、34.75℃、1∶3.225(g/mL）和117W，在此条件下矿物油提取量达到最大值3.215mg/kg。为进一步验证该模型的有效性，同时结合仪器条件将最佳条件分别修改为：26min、35℃、1∶3.2(g/mL）和120W，该条件下，矿物油提取量达3.127mg/kg，和预测值3.215mg/kg基本一致，其中相对偏差为2.74%，说明模型很好地预测了矿物油提取量，该优化工艺条件相对可靠[20,21]。

2.3矿物油定性及定量分析

在1.2.4色谱条件下C7～C40正构烷烃混合标准溶液和巧克力中矿物油的色谱图如图6所示。

正构烷烃C9～C40的分子式、分子量及标准曲线方程见表5。

图5各因素交互作用对矿物油提取量的响应面图

图6GC色谱图

表5正构烷烃C9～C40的分子式、分子量及标准曲线方程

续表5正构烷烃C9～C40的分子式、分子量及标准曲线方程

由于C7、C8发生挥发损失，未检测出相关谱图，以GC谱图中C9～C40正构烷烃混合标准工作液的峰面积（y）与相应浓度（x）绘制曲线，所得相应标准曲线的相关系数均趋近于1，说明C9～C40正构烷烃混合标准工作液在0.32mg/L～200mg/L浓度范围内线性关系良好。

采用标准曲线和内标法结合法进行定性定量分析，得到待测样品中矿物油种类及含量，内标法计算待测样品中矿物油含量（mi）公式如下：

式中：Ai和As分别为待测样品中矿物油和内标物的峰面积或峰高；ms为加入内标物的量，mg/L;f为相对校正因子。

式中：As和Ar分别为内标物和混合标准溶液中矿物油的峰面积或峰高；ms和mr分别为加入内标物和混合标准溶液中矿物油的量，mg/L[22]。

2.4检出限和定量限

由1.2.5计算得该检测方法的LOD和LOQ分别为0.26mg/kg和0.78mg/kg，可满足日常检测需求。

2.5加标回收率

在试验1.2的基础上，将巧克力作为基质，分别添加1.5、3.0、6.0mg/kg的C7～C40正构烷烃混合标准溶液进行加标回收试验并检测，得加标回收率为85.2%～97.4%，相对标准偏差在0.37%～1.33%之间，满足分析检测的要求[23]。

2.6样品分析

对市售的10种巧克力样品进行分析检测，结果见表6。

结果表明，10种巧克力样品中均能检测到矿物油，平均含量介于1.047mg/kg～7.073mg/kg之间，其中2号和6号样品中矿物油含量较高，污染来源可能是生产过程中使用含有矿物油的脱模剂和防黏剂，也可能源于包装材料上矿物油的迁移。但是目前国内对巧克力中矿物油含量没有明确的限量要求，随着人们对矿物油毒理学的认识，巧克力中矿物油污染问题逐渐引起了广泛的关注。

表6不同巧克力样品中的矿物油含量

3、结论

本研究采用超声辅助提取巧克力中的矿物油，并通过响应面优化，得最佳提取条件：提取时间26min，提取温度35℃，料液比1∶3.2(g/mL），超声功率120W。气相色谱检出限为0.26mg/kg，定量限为0.78mg/kg，加标回收率为85.2%～97.4%，相对标准偏差在0.37%～1.33%之间，采用该提取检测方法测定了市售10种巧克力样品中的矿物油含量，结果表明，10种巧克力样品中均存在矿物油污染的情况，矿物油平均含量介于1.047mg/kg～7.073mg/kg之间，本课题组将继续深入研究探讨巧克力中矿物油的污染和迁移问题，为食品监管及立法提供数据支持。

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