1、引言

哈维氏弧菌和溶藻弧菌等水产病原弧菌是养殖环境中的重要病原菌,可感染石斑鱼、银鲷、军曹鱼、鲈鱼、对虾、蟹类等多种水产养殖品种,给养殖业造成巨大的损失[1,2,3,4]。另外,它们还可通过食物和水传播,进而感染人类,严重威胁公共安全[5,6]。因此,对这些弧菌进行快速的检测和鉴定十分必要。但由于弧菌的种类多、变异快、基因相似度较高,传统的微生物培养法和16SrDNA等检测方法对弧菌的检测鉴定效果并不理想[7,8]。

核酸适配体是经体外筛选得到的、长度>10nt的寡核苷酸序列,可以高效、特异地与靶目标结合,在病原微生物的识别检测、食品安全和靶向治疗等领域得到广泛的关注[9,10,11,12]。然而,目前筛选出的病原微生物的核酸适配体大多识别的是微生物上的特异性位点。

微生物的表面存在有多种位点,有些位点是某种微生物所独有的特异性位点,有些位点则是一些微生物上结构相同或相似的位点,即共有位点。共有位点中有些是同种或同属微生物所共有的,具有种属特异性,可以作为微生物种属鉴定的标记位点。对这些共有位点进行识别,筛选其共有核酸适配体,不仅有助于对这些微生物进行总量分析,对于相关微生物的种属鉴定也具有重要意义。对于不同病原微生物中共有位点的识别及其核酸适配体的筛选,目前还未见报道。本研究以溶藻弧菌和哈维氏弧菌为共同的靶目标,筛选能特异性识别这两种弧菌共有位点的核酸适配体,为后续这两种微生物的识别检测及其种属的识别鉴定奠定了基础。

2、实验部分

2.1仪器与试剂

BIO-TEK全自动酶标仪(美国SynergyHT公司);MG96GPCR仪(杭州朗基科学仪器有限公司);BioDoc-It凝胶成像一体机(美国UVP公司);TGL-16C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);JM-250电泳仪和电泳槽(大连竟迈生物科技有限公司);SW-CJ超净工作台(苏州泰安空气技术有限公司);HI98127pH计(意大利Hanna公司);DM5000B荧光显微镜(德国莱卡公司)。

随机ssDNA文库:5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC-N35-GCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3′(两端为与引物结合的固定序列,中间为35nt的随机序列);引物P1:5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC-3′,引物P2:5′-CCCTCTGGGGTCTCCCTCTTGTGC-3′,引物P3:5′端标记有地高辛的引物P1;5′端标记有FAM荧光基团的核酸适配体C14:FAM-5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGAGCCCAGAGGG-3′;5′端标记有FAM荧光基团的核酸适配体C22:FAM-5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCTGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCACAAGAGGGAGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGAGCCCAGAGGG-3′。以上文库、引物及核酸适配体序列均由上海生工生物公司合成和标记。DreamtaqDNA聚合酶和缓冲液购自Fermentas公司;dNTP购自GenerayBiotech公司;DNAmarker购自天根生化科技有限公司;琼脂糖购自厦门太阳马生物工程有限公司;辣根过氧化物酶标记的兔抗地高辛抗体购自北京博奥森生物技术公司。实验用水均为超纯水。

20×结合缓冲液:5.844gNaCl、3.725gKCl、6.06g三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)和2.033gMgCl2·6H2O用超纯水溶解并定容至100mL,调pH至7.4,使用时用超纯水稀释为2×和1×缓冲液。番红染色液:番红O(safranine)2.5g,溶于100mL95%乙醇中,配成番红原液,于密闭的棕色瓶中避光保存。使用时稀释5倍,配成番红染色液。

2.2微生物及培养基

目标菌:哈维氏弧菌(V.harveryi)、溶藻弧菌(V.alginolyticus);非目标菌:嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)、大肠杆菌(Escherichiacoli)。大肠杆菌采用LB培养基进行培养,其它菌采用胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)进行培养。所用微生物由集美大学病原微生物实验室提供。

图1共有核酸适配体的筛选流程图

2.3共有核酸适配体的筛选

2.3.1ssDNA文库与目标菌哈维氏弧菌结合

筛选流程如图1所示,具体过程如下:分别取哈维氏弧菌菌液(含菌量为4×108个),6000r/min离心5min,弃上清液,1×结合缓冲液洗涤1次,2×结合缓冲液100μL悬浮菌沉淀;然后取10μmol/L随机ssDNA文库30μL,用2×结合缓冲液稀释至100μL,95℃变性5min,冰浴10min后,加入到上述菌悬液中,30℃,100r/min摇振结合一定时间:第1和第2轮的筛选分别结合2h,第3轮筛选结合1h,第4轮以后的筛选结合0.5h。完成结合后的菌悬液于6000r/min离心5min,弃上清液,用1×结合缓冲液洗沉淀1～3次(其中,第1和第2轮筛选洗涤1次,第3轮筛选洗涤2次,第4轮以后的筛选洗涤3次),洗去未与目标菌哈维氏弧菌结合的或结合较弱的ssDNA。再在沉淀中加入1×结合缓冲液100μL重悬,96℃加热5min,使与目标菌结合的ssDNA变性,从而与目标菌分离,15000r/min离心10min,取上清液,得到可与目标菌哈维氏弧菌结合的ssDNA。

2.3.2与目标菌溶藻弧菌结合

将分离到的可与哈维氏弧菌结合的ssDNA(约100μL),按照2.3.1节的方法与溶藻弧菌菌液结合和分离,从而得到能同时结合哈维氏弧菌和溶藻弧菌的ssDNA。

2.3.3不对称PCR扩增

25μLPCR反应体系:1μL10μmol/L引物P1,1μL0.2μmol/L引物P2,0.4μL10mmol/LdNTP,2μL10×PCRBuffer,1.2μL25mmol/LMgCl2,2μL模板(即经过2.3.1和2.3.2节后分离得到的ssDNA),0.2μL5U/μLDNA聚合酶,17.2μLddH2O。PCR循环参数:94℃预变性4min,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸20s;40个循环,最后于72℃延伸7min。

2.3.4循环重复筛选

取不对称PCR产物100μL作为次级文库,依次与目标菌哈维氏弧菌和溶藻弧菌(数量各为4×108个)结合,重复上述2.3.1至2.3.3节中的步骤,共进行8个循环的筛选。

2.3.5反筛

为提高核酸适配体的特异性,分别在第4轮用非目标菌嗜水气单胞菌进行了一次反筛,在第6轮用迟钝爱德华氏菌进行了一次反筛,以去除能与嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌结合的ssDNA。具体方法如下:取非目标菌菌液(含菌量为4×108个),按2.3.1节的方法与次级文库100μL结合0.5h,然后以6000r/min离心5min,取上清液,再按2.3.1到2.3.3节中步骤进行正常筛选。

2.4克隆测序及结构分析

以最后一轮(即第8轮)筛选产物作为模板,进行常规PCR扩增。25μLPCR体系:0.5μL10μmol/L引物P1,0.5μL10μmol/L引物P2,0.5μL10mmol/LdNTP,2.5μL10×PCRbuffer,1.5μL25mmol/LMgCl2,2μL模板,0.25μL5U/μLDNA聚合酶,17.25μLddH2O;热力学循环参数:94℃预变性4min,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸20s;扩增35个循环;最后72℃延伸7min。PCR产物由上海美吉生物医药科技有限公司进行克隆测序。对测序获得的一级结构序列用DNAMAN软件进行同源性分析,并构建同源树,二级结构用RNAstructure4.6软件按能量最低原则进行模拟分析。

2.5地高辛-抗体-过氧化物酶法测定核酸适配体的亲和力

参考文献[13]方法,利用地高辛-抗地高辛抗体-过氧化物酶法测定核酸适配体的亲和力。其原理为:有地高辛标记的核酸适配体与菌结合后形成地高辛标记的复合物,用辣根过氧化物酶标记的抗地高辛的抗体识别和结合菌复合物上的地高辛,形成辣根过氧化物酶-抗体-地高辛-核酸适配体-菌的复合物,最后通过辣根过氧化物酶的显色反应产生的OD值表征与菌结合的适配体的亲和力,显色越深,OD值越高,亲和力越高。其中,筛选过程中筛选产物的亲和力测定是通过PCR将地高辛标记到核酸适配体上,而纯核酸适配体的亲和力测定中,则是直接采用已标记有地高辛的核酸适配体,无需PCR扩增。具体方法如下所述。

2.5.1筛选产物的亲和力测定

筛选产物是筛选过程中获得的含有多种适配体的混合物,对其进行亲和力测定可以跟踪反映筛选进行的效果。分别取哈维氏弧菌和溶藻弧菌菌液(各4×108个),1×结合缓冲液洗涤1次,弃上清液;2×结合缓冲液100μL悬浮菌沉淀后,将两种菌悬液混合作为靶目标菌液。同时用引物P2和P3(即带地高辛标记的P1引物)对各轮筛选产物进行不对称PCR扩增(不对称PCR参数同上,用引物P3代替引物P1),得到各轮筛选产物的不对称PCR产物。取这些带有地高辛标记的不对称PCR产物各50μL于离心管中作为实验组,同时用2×结合缓冲液50μL代替不对称PCR产物作为对照组,于95℃变性5min,然后冰浴10min后,加到上述100μL的目标菌悬液中,30℃下,100r/min摇床结合30min;6000r/min离心5min,弃上清液,1×结合缓冲液洗涤1次,然后加入100μL用TBS稀释过的辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体(稀释的体积比为抗体∶TBS=1∶1000),充分混合后反应10min;离心,弃上清液,1×结合缓冲液洗涤3次,加入200μLTMB显色液避光显色10min后,用200μL2mol/LH2SO4终止反应,用酶标仪于450nm测定OD值,获得相应的亲和力:亲和力=OD450(实验组)-OD450(对照组)。

2.5.2核酸适配体的亲和力测定

分别取标有地高辛的核酸适配体各50μL(0.2μmol/L)作为实验组,用2×结合缓冲液50μL代替适配体作为对照组,按2.5.1节的方法与菌液结合、洗涤后进行显色反应,用酶标仪测450nm的OD值,获得相应适配体的亲和力:亲和力=OD450(实验组)-OD450(对照组)。

2.6亲和常数的测定

将5′端标记地高辛的核酸适配体稀释到不同浓度,浓度范围为0～140nmol/L,然后分别与等量的哈维氏弧菌(4×108个)结合,按2.5.2节方法测定相应浓度下此适配体的亲和力。以适配体浓度为横坐标,亲和力为纵坐标,用Origin8.0软件的Hyperbola函数对数据进行拟合分析,获得相应适配体与哈维氏弧菌的结合曲线、亲和常数Kd值及其拟合系数。按同样的方法可得到适配体与溶藻弧菌的结合曲线、亲和常数和拟合系数。

2.7荧光显微镜观察验证适配体的亲和性和特异性

用2×结合缓冲溶液将浓度为10μmol/L的5′端标记有荧光基团FAM的核酸适配体稀释3000倍,然后于95℃变性5min,冰浴10min。各取100μL浓度为108cfu/mL菌液于6个离心管中,在3管中加入100μL上述处理过的核酸适配体作为实验组,另外3管加入100μL2×缓冲溶液作为空白对照组,然后在30℃、100r/min摇床结合30min。然后6000r/min离心5min,弃上清液,2×结合缓冲溶液洗涤2次后,用100μL2×结合缓冲溶液重悬。取重悬后的混合菌液1μL涂于玻片上,酒精灯加热固定,再用番红染液染色1min后,用超纯水洗净,晾干后,置于荧光显微镜下观察对照组和实验组在明场(Brightfield)和荧光(Fluorescence)下的图片。

2.8统计分析

实验数据采用Excel软件中的t-检验函数进行组间差异分析,p<0.05为有显著差异,p<0.01为有极显著差异。

3、结果与讨论

3.1核酸适配体的筛选

筛选过程中亲和力随着筛选轮数的增加而上升,从第1轮的0.0150上升到第8轮的0.3765,上升了24.1倍(图2),说明随着筛选进行,结合到目标菌上的核酸适配体逐步增加;最后的第7轮和第8轮的亲和力已无显著差异(p>0.05),说明结合到两个目标菌哈维氏弧菌和溶藻弧菌上的核酸适配体数量已基本饱和。对第8轮的筛选产物进行PCR扩增和测序,并利用DNAMAN软件对测序获得的序列进行同源性分析,获得同源树(图3),同源树节点处的百分数表示该节点左边所涉及的核酸适配体之间的同源性比率。由图3可见,在第8轮的筛选产物中,有相当多的核酸适配体,其同源性已达到90%以上,有些甚至达到了100%,而最初筛选所用的随机文库中,其随机ssDNA的同源性理论上是接近零的,这说明随着筛选进行,筛选文库中ssDNA的同源性在快速增加,适配体序列在一级结构上呈现出明显的收敛性。这也说明,经过8轮筛选,初始随机文库中的ssDNA呈现出明显定向进化趋势,文库中与目标菌有较好亲和力的核酸适配体得到了较好的富集。

有关病原菌核酸适配体的筛选已有文献报道,但不同的研究针对不同的靶细菌,筛选效率差异较大。Marton等[14]以大肠杆菌为靶细菌,经过12轮筛选,获得的富集库的亲和力比初始文库大约提高了6倍,Yang等[15]以沙门氏菌为靶目标,经过17轮筛选,富集库对靶细菌的亲和力提高了9倍以上,Yu等[16]以溶藻弧菌为靶目标,经过7～9轮筛选,其富集库的亲和力提高了约4倍。本研究则以溶藻弧菌和哈维氏弧菌作为共同靶细菌,经过7～8轮筛选,获得了亲和力提高了24.1倍的富集库,显示出较高的筛选效率,筛选效率的提高可能与反筛和逐步增加的洗涤次数有关。在第4轮和第6轮分别增加了对嗜水气单胞菌(A.hydrophila)和迟钝爱德华氏菌(E.tarda)的反筛,较好去除了一些非特异性结合的ssDNA。同时,在第1和第2轮分别洗涤1次,第3轮洗涤2次,第4～8轮都分别洗涤3次,有效去除了一些亲和力较弱的核酸适配体,从而使最终富集文库中适配体的亲和力得到较大提升。

3.2共有核酸适配体的亲和性和特异性

图3的同源树是根据适配体序列的同源性大小,采用DNAMAN软件通过同源性分析得到的,其节点处的百分数表示所涉及的核酸适配体之间的同源性比率。从图3可见,同源性较高、适配体数量较多的主要有两个群体,一个是同源性在87%以上、由14个核酸适配体组成的群体(C1、C17、C16、C39、C22、C34、C5、C8、C9、C42、C32、C23、C35、C24),另一个是同源性在92%以上、由13个适配体组成的群体(C14、C25、C48、C7、C37、C28、C29、C15、C27、C30、C6、C31、C38),其它适配体由于数量较少或同源性不够高,缺乏代表性。因此,从有代表性的两个群体中各选择出一个核酸适配体,即适配体C14和C22,进行亲和性和特异性考察、亲和常数的测定及其二级结构模拟。图4显示了这两个共有核酸适配体对目标菌的亲和性和特异性,可见两个核酸适配体对目标菌哈维氏弧菌和溶藻弧菌的亲和力都显著高于非目标菌嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌(p<0.01),对哈维氏弧菌的亲和力也显著高于溶藻弧菌(p<0.01),说明这两个核酸适配体不仅能区分目标菌和非目标菌,还能区分同为弧菌属的哈维氏弧菌和溶藻弧菌,显示出较好的亲和性和特异性。

图2筛选过程中核酸适配体富集库对目标菌的亲和力变化

图3哈维氏弧菌和溶藻弧菌共有核酸适配体的同源树

图4共有核酸适配体C14和C22对哈维氏弧菌(Vh)、溶藻弧菌(Va)、嗜水气单胞菌(Ah)和迟钝爱德华氏菌(Et)的亲和力比较

3.3共有核酸适配体的亲和常数及其二级结构

两个核酸适配体C14和C22对目标菌哈维氏弧菌和溶藻弧菌的亲和常数Kd及其拟合曲线如图5所示,两个核酸适配体对哈维氏弧菌的Kd都比溶藻弧菌低,说明两个适配体对哈维氏弧菌的亲和力要更高,这与上述亲和性和特异性的研究结果是一致的。

图5共有核酸适配体C14、C22与哈维氏弧菌和溶藻弧菌的结合曲线

目前报道的核酸适配体的Kd多在pmol/L～nmol/L水平[17]。水产病原弧菌中,哈维氏弧菌核酸适配体的Kd在10～50nmol/L之间[18],副溶血弧菌核酸适配体的Kd在10～30nmol/L之间[19],溶藻弧菌适配体的Kd则在10～100nmol/L之间[13,16,20],而本研究得到的这两个共有适配体,其对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的Kd也都是介于10～100nmol/L,与上述研究结果相近。

软件模拟出的两个核酸适配体(含两端固定序列)的二级结构如图6所示,以茎环和口袋结构为主,茎以G-C配对为主。两个适配体都含有6个封闭环,C14的封闭环较小,C22的封闭环较大,而且C22的3′端结构要比C14更复杂些。越复杂的结构,其Kd通常会较小,亲和力通常也较高,这可能是因为较复杂的结构可能有较多的位点能与靶目标结合,从而能够提高其对靶目标的亲和力,这与本研究组前期的研究结果相近[18]。

3.4荧光显微镜鉴定

如图7所示,目标菌哈维氏弧菌、溶藻弧菌和非目标菌嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、大肠杆菌自身均无明显的荧光(如图7的Vh,Va,Ah,Et,Ec),加入FAM荧光标记的适配体C14或C22后,目标菌哈维氏弧菌和溶藻弧菌均呈显明显的黄绿色荧光(如图7的Vh+C14,Vh+C22,Va+C14,Va+C22),但非目标菌嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和大肠杆菌则未呈现出明显的荧光(如图7的Ah+C14,Ah+C22,Et+C14,Et+C22,Ec+C14,Ec+C22),说明这两个核酸适配体都能与哈维氏弧菌、溶藻弧菌特异结合,使这两种目标菌呈现出荧光,但对非目标菌嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和大肠杆菌则基本不结合,进一步证明这两个核酸适配体对哈维氏弧菌和溶藻弧菌有较好的亲和性和特异性。

图6共有适配体C14(A)和C22(B)的二级结构模拟图,ssDNA按能量最低原则进行拟合

图7放大200倍荧光显微镜下,哈维氏弧菌(Vh)、溶藻弧菌(Va)、嗜水气单胞菌(Ah)、迟钝爱德华氏菌(Et)和大肠杆菌(Ec)的及其与核酸适配体C14或C22结合后的图像

4、结论

经过8轮筛选,获得了能识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的共有核酸适配体富集文库,富集文库的亲和力提高了24倍以上。研究了两个核酸适配体C14和C22的亲和性和特异性,结果表明,两个核酸适配体对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有较好的亲和性和特异性,但对哈维氏弧菌的亲和力要显著高于溶藻弧菌。Kd的测定结果也表明,两个核酸适配体对哈维氏弧菌的Kd都比溶藻弧菌低,说明两个适配体对哈维氏弧菌的亲和力要更高。最后,用荧光显微镜进一步证明了这两个核酸适配体对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有较好的亲和性和特异性,可用于这两种弧菌的识别鉴定。利用核酸适配体进行微生物的种属鉴定具有快速、准确、便捷的特点,但是由于核酸适配体是通过空间结构来识别微生物的,因此当微生物的形态结构出现较大变化,影响到相应识别位点的结构时,对核酸适配体的识别鉴定效果也会产生一定影响。

参考文献：

[18]郑江,郝聚敏,宋林生,刘瑞.生物化学与生物物理进展,2014,41(7):704-711

刘慧敏,郝聚敏,许净,鄢庆枇,高晗,郑江.哈维氏弧菌与溶藻弧菌共有核酸适配体的筛选及鉴定[J].分析化学,2020,48(05):623-631.

基金:福建省自然科学基金项目(No.2018J01455);鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心开放基金项目(No.RE201808);福建省水产生物育种与健康养殖工程研究中心开放基金课题项目(No.DF201901);福建省特种水产配合饲料重点实验室开放课题项目(Mo.TMKJZ1909)资助.