关节软骨损伤是骨科常见病，可导致关节疼痛、变形，并影响关节功能。有资料显示[1],关节软骨损伤的发病率呈增长趋势，我国每年仅运动引起的关节软骨损伤发病人数便高达6 500万。而如何修复关节软骨损伤目前仍是难题。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是目前研究最多和应用最广的首选软骨修复种子细胞，可自我更新并且具有多向分化潜能，其成骨分化特性是组织工程学研究的热点[2,3]。BMSCs的成骨定向诱导分化主要是指将有成骨作用的基因转入靶细胞并调控靶基因使其在病区转录成蛋白质，进而促进自身成骨，修复损伤的骨组织，在关节软骨损伤、骨不连及骨代谢障碍等疾病患者中均有较高的应用价值。微小核糖核酸(miR)-876可促进人颌骨BMSCs成骨分化[4,5]。整联蛋白β(ITGB)2/局部黏着斑激酶(FAK)则是BMSCs成骨分化的重要通路，有研究[6]指出激活该通路可促进BMSCs成骨分化。另有报道显示[7],miR-876可靶向ITGB2信号通路参与细胞增殖、分化过程。然而miR-876是否可通过靶向该信号通路影响BMSCs的成骨分化尚未可知，而探讨该问题有助于组织工程学技术的发展和软骨损伤修复的创新治疗。故此，本研究通过基因干扰和转染技术探讨上述问题。

1、材料和方法

1.1实验动物

SD雄性大鼠1只，体质量95 g, 4周龄，清洁级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2020-0001,动物使用伦理审批号IACUC2020-004。

1.2主要药品和试剂

改良伊格尔(DMEM)培养基(大连美仑生物技术有限公司，批号MA0214);磷酸盐缓冲液(PBS)、封闭缓冲液(BSA)、Cellytic Buffer细胞裂解液(上海西格生物科技有限公司，批号XG-R95672、XG-R95411、C2978);miR-876模拟物阴性对照(miR-876 mimics-NC)、miR-876模拟物(miR-876 mimics)、miR-876抑制剂阴性对照(miR-876 inhibitor-NC)和miR-876抑制剂(miR-876 inhibitor)核酸序列及miR-876、ITGB2、FAK、Runt相关转录因子(Runx)2、骨钙蛋白(OCN)、骨相关转录因子抗体(Osterix)、碱性磷酸酶(ALP)及内参引物序列均委托宝生物(大连)有限公司合成；Lipofectamine3000脂质体(北京诺博莱德科技有限公司，批号L3000-015);ALP底物试剂盒(上海懋康生物科技有限公司，批号MP7501);茜素红染色试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司，批号C01384、YS-W-C202);Trizol试剂(上海联迈生物工程有限公司，批号LM-0010);抗体稀释液、兔抗鼠ITGB2、FAK、Runx2、OCN、Osterix、ALP单克隆抗体(一抗，均1:1 000),羊抗兔ITGB2、FAK、Runx2、OCN、Osterix、ALP多克隆抗体(二抗，酶标记，均1∶2 000)(Abcam中国公司，批号ab64211、ab52627、ab71559、ab264077、ab93876、ab209484、ab224335;ab288151、ab136636、ab102279、ab98459、ab98467、ab7171);Luciferase Assay System荧光检测试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，批号AC19L021)。

1.3主要设备和仪器

5430R型离心机、BIOSPECTROMETER型分光光度计(德国eppendorf公司);DM750型普通光学显微镜(德国Leica公司);CKX53型倒置相差显微镜、BX41-32P02-FLB3型荧光显微镜(日本Olympus公司);FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD公司);12620-932型平板振荡机(美国VWR公司);DiGi-13型聚合酶链反应(PCR)仪(德国IBA公司);CelDocEZ型凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.4鼠BMSCs的提取、培养与鉴定

戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔麻醉大鼠，并将其固定于无菌操作台。分离股骨、胫骨，在长骨两端打孔并以不含血清的培养液冲洗直至骨髓腔骨头变白。将骨髓液1 000 r/min离心分离10 min(离心半径10 cm),并用含10%胎牛血清的培养液重悬细胞，制作单细胞悬液，接种于培养瓶中常规培养。72 h后更换培养液，待细胞生长至80%融合传代，将获取的细胞消化、制作单细胞悬液。用倒置相差显微镜观察细胞形态学改变，并采用流式细胞仪荧光激活细胞分选技术鉴定细胞的表型，具体：使用鼠CD29、CD44、CD45、CD90抗体与同种型对照鼠免疫球蛋白(Ig)G抗体，将收集的细胞采用PBS洗涤，BSA封闭，加入藻红蛋白结合抗体4℃温育30 min,采用同种型IgG作为非特异性染色对照品；荧光标记二抗温育并洗涤、固定细胞，上机检测。

1.5 miR-876干扰质粒、载体的构建及共培养

构建miR-876干扰质粒，包括miR-876 mimics-NC(正义链：5′-AUCGCGAGAGCUA-3′,反义链：5′-CGU-UAUACGCGAAC-3′)、miR-876 mimics(正义链：5′-CUGAGAUCUUAAC-3′,反义链：5′-CGAGAUAUAU-CGAAAA-3′)、miR-876 inhibitor-NC(正义链：5′-AUCUGAUAUGCGAUAC-3′,反义链：5′-CGAGAUAGA-GAGGACUCUA-3′)和miR-876 inhibitor(正义链：5′-CGUAUAGAGCUAAGACAA-3′,反义链：5′-AUCGGCUAUAGAGCUAG-3′),各取不含血清和抗生素的培养液Opti-MEM稀释合成的、带荧光标记的核酸序列0.8μg,另取50μl不含血清和抗生素培养液的Lipofectamine3000脂质体，混合静置10 min。将鼠BMSCs消化，用不含血清和抗生素的培养液制成单细胞悬液接种于含转染液的24孔板，细胞密度4.0×104/450μl,轻柔晃动，37℃孵育12 h,更换为完全培养液，分别记为过表达阴性对照组、过表达组、沉默阴性对照组、沉默组，另设置空白对照组(未转染，仅鼠BMSCs培养),每组设置5个复孔。72 h后测定转染效率，具体：在普通光学显微镜和绿色荧光显微镜下观察并计数，转染效率=绿色荧光显微镜下发光细胞数/普通光学显微镜下细胞数×100.00%。

1.6早期成骨分化检测

采用ALP染色及活性定量实验检测。培养1 w后采用PBS洗涤细胞后加入裂解液，平板振荡机处理60 s,后37℃孵育15 min,加入终止液再振荡60 s。使用分光光度计测定405 nm处的波长。

1.7晚期钙盐沉积检测

采用茜素红染色检测。培养2 w后采用茜素红染色，将各组细胞采用PBS洗涤，4%多聚甲醛固定，15 min后PBS冲洗3次，5 min/次。加入2%茜素红染液，30 min后PBS冲洗，显微镜下观察，并采用分光光度计检测各孔的吸光度值(OD)。

1.8 miR-876、ITGB2、FAK及成骨分化特异性标志物信使核糖核酸(mRNA)表达检测

培养2 w后采用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测。Trizol试剂抽提总RNA,反转录为互补的脱氧核糖核酸(cDNA),其中miR-876的内参为U6,其余基因的内参均为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),PCR引物序列miR-876上游5′-CTGAGATGCGTATAGCTA-3′、下游5′-AGAGGAGAGCTTTCTCGA-3′,128 bp; U6上游5′-AGAGTCTCGAGAGT-3′、下游5′-CGGATAG-AGCTAGA-3′,144 bp; ITGB2上游5′-CTGAGATTCGGATAGCTAA-3′、下游5′-CGGGATATATACATAGC-3′,240 bp; FAK上游5′-CGCGTAGAGCTAGACTAG-3′、下游5′-CGGCTCTGAGATCTAGACT-3′,216 bp; Runx2上游5′-CGTGAGAGATGGATAGCAAA-3′、下游5′-ATAGAGCTCTAAGAAATC-3′,268 bp; OCN上游5′-ATAGCTAGGAGATCTAG-3′、下游5′-ATAGGCTTAAGGCTAG-3′,164 bp; Osterix上游5′-AG-AGCTGAGAGAGGC-3′、下游5′-CGCGGATTATATGCTA-3′,172 bp; ALP上游5′-GGATATGCGCGGCGCGATAGCAA-3′、下游5′-CGGCTATAGGAGC-TAGAGCTAGAAAC-3′,286 bp; GAPDH上游5′-AGATAGAGCTATAGCAAA-3′、下游5′-CGTATAGCGTATAGCGTA-3′,192 bp。PCR体系：2×qPCR Mix 12.5μl、2.0μl 7.5μmol/L基因引物、2.5μl反转录产物、8.0μl双蒸水(ddH2O);PCR流程：预变性(95℃、10 min)、循环40次(95℃、15 s, 60℃、60 s)、熔解曲线(60～90℃,每15 s升温0.3℃)。计算2-ΔΔCt。

1.9 ITGB2、FAK及成骨分化特异性标志物蛋白表达检测

培养2 w后采用Western印迹检测。BCA试剂盒提取总蛋白并定量，电泳、转膜、封闭。以抗体稀释液对一抗稀释，4℃孵育过夜；以抗体稀释液对二抗稀释，室温孵育过夜1 h。电化学发光液染色，并以凝胶成像系统分析条带，内参为β-actin,计算目的蛋白条带与内参条带灰度值的比值。

1.10 ITGB2是miR-876的靶基因的验证方法

培养2 w后采用荧光素酶报告基因实验，按照荧光检测试剂盒操作，具体：每孔加入20μl裂解液，37℃、20 min。将裂解液混匀并转移至不透光的白板。每孔加入100μl检测液，快速检测其发光情况，采用分管光度计测量，以与光吸收量相关的数字代表荧光素酶活性。

1.11统计学方法

采用SPSS24.0软件进行正态性和方差齐性检验，多样本间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。

2、结 果

2.1鼠BMSCs鉴定

倒置相差显微镜下显示，初始BMSCs细胞多呈卵圆形，少部分呈圆形，培养72 h后细胞多呈梭形或多角形，具有成骨细胞形态，见图1;流式细胞仪检测鼠BMSCs细胞表型，发现CD29、CD44、CD90表达率分别为99.25%、98.13%、99.10%,而CD45表达率为0.21%,见图2。

2.2转染效率

过表达阴性对照组、过表达组、沉默阴性对照组、沉默组转染效率分别为(82.50±10.11)%、(80.28±8.95)%、(83.07±9.26)%、(81.58±9.35)%,见图3。

图1倒置显微镜下鼠BMSCs细胞(×100)

图2流式细胞仪检测鼠BMSCs细胞表型

2.3各组早期成骨分化检测

培养1 w后，过表达组ALP活性显著高于过表达阴性对照组和空白对照组(P<0.05),沉默组ALP活性显著低于沉默阴性对照组和空白对照组(P<0.05),见表1。

2.4各组晚期钙盐沉积检测

茜素红染色结果显示，过表达组细胞的钙矿物红色沉着均较过表达阴性对照组和空白对照组加深，沉默组细胞的钙矿物红色沉着均较沉默阴性对照组和空白对照组变浅，见图4。

2.5各组ITGB2、FAK及成骨分化特异性标志物蛋白表达检测

过表达组ITGB2、FAK、Runx2、OCN、Osterix、ALP蛋白表达均高于过表达阴性对照组和空白对照组(P<0.05),沉默组ITGB2、FAK、Runx2、OCN、Osterix、ALP蛋白表达均低于沉默阴性对照组和空白对照组(P<0.05),见表1、图5。

图3各组转染效率检测(荧光素染色，×200)

表1各组ALP活性和ITGB2、FAK及成骨分化特异性标志物蛋白表达对比

图4各组晚期钙盐沉积检测(茜素红染色，×100)

图5各组ITGB2、FAK及成骨分化特异性标志物蛋白表达

1～5:沉默阴性对照组、过表达阴性对照组、空白对照组、过表达组、沉默组

2.6各组miR-876、ITGB2、FAK及成骨分化特异性标志物mRNA表达检测

过表达组miR-876、ITGB2、FAK、Runx2、OCN、Osterix、ALP mRNA表达均显著高于过表达阴性对照组和空白对照组(P<0.05),沉默组miR-876、ITGB2、FAK、Runx2、OCN、Osterix、ALP mRNA表达均显著低于沉默阴性对照组和空白对照组(P<0.05),见表2。

2.7 ITGB2是miR-876的靶基因验证

观察ITGB2的基因序列，并通过荧光素酶实验检测证实ITGB2是miR-876的靶基因，见图6、表3。miR-876组野生型(WT)荧光素酶活性显著低于阴性对照组(P<0.001)。

表2各组miR-876、ITGB2、FAK及成骨分化特异性标志物mRNA表达对比

图6荧光素酶报告基因实验验证ITGB2是miR-876的靶基因

表3 miR-876与阴性对照ITGB2 WT和Notch-1 Mut相对荧光素酶活性比较

3、讨 论

BMSCs成骨分化在骨组织工程领域有良好的应用前景，也是当前多种骨病治疗研究的热点。目前常用的诱导BMSCs成骨分化的方法有药物(如常用的西药辛伐他汀、骨肽等和中药成分当归多糖、刺五加苷等)[8～10]、基因干扰等，而药物诱导BMSCs成骨分化仍存在诸多问题：如临床用药的剂量、安全性等；基因干扰则是通过调控蛋白转录影响成骨分化特异性标志物的表达实现诱导BMSCs成骨分化的，且该方案效率稳定、安全性高，还有助于深入挖掘多种骨病的发生机制[11,12]。因此该领域工作者应重点探讨基因干扰对BMSCs成骨分化的影响。

miR-876对BMSCs成骨分化的调控作用已有大量报道证实[13～15]。本研究取鼠BMSCs分离、培养后鉴定证实符合此类细胞的生长特性，与既往Li等[16]报道相符，证实为鼠BMSCs且为后续实验提供了有力的条件。此外，本研究构建了miR-876干扰质粒，并转染Lipofectamine3000脂质体，经普通光学显微镜和绿色荧光显微镜观察发现各组转染效率均>80%,证实转染效率高，结合本研究各组miR-876表达对比结果，可知转染miR-876 mimics、miR-876 inhibitor质粒的载体与鼠BMSCs共培养可上调、下调miR-876表达。

本研究关于鼠BMSCs的早期成骨分化和晚期钙盐沉积结果提示，miR-876过表达有助于促进鼠BMSCs成骨分化，而miR-876沉默则可抑制鼠BMSCs成骨分化。miR-876是一种十分重要的生物分子，目前已发现其异常表达与心血管疾病、肿瘤、骨病等发生和发展均有关。有研究显示[17],miR-876表达可调控破骨细胞生成，也有研究发现上调miR-876或者转基因表达也可影响骨再吸收，增加骨质。本研究与上述报道结果一致，提示miR-876基因转染可能是增强鼠BMSCs成骨分化活性的重要途径。

miR-876能够与ITGB2基因的3′UTR相结合，进而调控其表达。miR-876转录后可靶向调控ITGB2基因和蛋白的表达[18]。而ITGB2通路则可参与骨形成，影响骨代谢[19]。本研究结果发现，过表达miR-876可上调鼠BMSCs ITGB2及其下游FAK的表达，激活成骨分化特异性标志物表达，而沉默miR-876则可抑制鼠BMSCs ITGB2及其下游FAK的表达，抑制成骨分化特异性标志物表达，并且经荧光素酶实验证实ITGB2是miR-876的靶基因，推测miR-876在BMSCs成骨分化诱导过程中具有重要的推动作用。ITGB2/FAK通路对骨形成有调控作用，其维持正常的信号转导可确保成骨细胞的正常分化[20]。杨扬等[21]发现，上调ITGB2表达可促进成骨分化，增加骨密度。Gupta等[22]研究显示，ITGB2通过正反馈调控其下游分子FAK的表达进而影响Runx2的形成，促使Hes-1与启动子结合，并增加Runx2的转录水平，与此同时OCN、Osterix、ALP等成骨分化特异性标志物的表达也增强。结合本研究结果和上述分析，推测过表达miR-876很可能是通过促进ITGB2及其下游FAK的表达进而影响Hes-1与Runx2的相互作用，促进Runx2、OCN、Osterix、ALP表达实现促进鼠BMSCs成骨分化的，反之同理。

综上所述，miR-876过表达可促进鼠BMSCs成骨分化，推测是通过激活ITGB2/FAK信号通路，上调Runx2、OCN、Osterix、ALP表达实现的；而miR-876基因沉默则可抑制鼠BMSCs成骨分化，推测是通过抑制ITGB2/FAK信号通路，抑制成骨分化特异性标志物表达实现的。

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基金资助:荆州市科学技术局资助项目(2019CC56-01);

文章来源:鲍运平,朱正荣,田丰,等.miR-876调控ITGB2/FAK信号通路对鼠BMSCs成骨分化的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(22):5568-5574.