卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，其病死率居妇科恶性肿瘤之首[1]。探讨与卵巢癌恶性生物学行为相关的因子具有重要意义。LncRNA MEF2C-AS1是一种新发现的长链非编码RNA,既往研究发现LncRNA MEF2C-AS1抑制胃癌[2]、宫颈癌[3]、结肠癌[4]细胞增殖和迁移。本课题组前期通过生物信息学分析发现LncRNA MEF2C-AS1在卵巢癌组织中低表达，其RNA水平与GRB7表达水平呈负相关[5]。本研究旨在进一步明确LncRNA MEF2C-AS1在卵巢癌恶性表型中的生物学功能，以期为明确LncRNA MEF2C-AS1在卵巢癌发生、发展中的作用提供理论依据及实验基础。

1、材料与方法

1.1试剂与材料

人卵巢癌A2780、SKOV3细胞购自昆明动物研究所；正常卵巢上皮IOSE80细胞、卵巢癌OVCAR3细胞购自上海赛百康细胞库；RPMI 1640培养基、DMEM培养基购自美国Hyclone公司；RNA提取试剂Trizol、PrimeScriptTMRT reagent试剂盒购自北京索莱宝公司；SYBR Green Master Mix试剂盒购自大连TaKaRa公司；CCK-8试剂盒购自苏州宇恒公司；LncRNA MEF2C-AS1过表达慢病毒及阴性对照病毒购自上海吉凯公司；GRB7抗体、Caspase3抗体、CyclinD1抗体、Bax抗体、β-actin抗体均购自日本abclonal公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养

IOSE80、SKOV3和A2780采用含10%FBS和1%青霉素-链霉素双抗溶液的DMEM培养基，OVCAR3采用含20%FBS和1%青霉素-链霉素双抗溶液的RPMI 1640培养基，均置于37℃、5%CO2恒温箱培养。

1.2.2细胞转染与分组

待细胞生长密度约50%～60%时，加1×105TU/mL的目的病毒或阴性对照病毒1μL,并添加适量感染增强剂。24h后用完全培养基替换含病毒液的培养基，继续培养2～3d。RT-qPCR检测转染效率，根据转染情况将细胞分为过表达组(LV-MEF2C-AS1)和阴性对照组(LV-NC)。

1.2.3定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse tran-scription PCR,RT-qPCR）

取对数生长期细胞，加1mL Trizol裂解液混匀，提取总RNA;使用PrimeScriptTMRT reagent试剂盒逆转录合成cDNA,使用SYBR Green Master Mix试剂盒进行PCR扩增。反应条件：95℃5s、60℃30s,循环40次；根据目的基因和内参Ct值，采用2-△△CT法计算目的基因水平。β-actin为内参基因，引物序列：LncRNA MEF2C-AS1:F:5'-CCAGGAAGGAAGTGACAGAAG-3';R:5'-GGATGATGCCATTCAGGTCTA-3';β-actin: F:5'-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3';R:5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'。

1.2.4 CCK-8实验

将细胞制成5×103细胞/mL细胞悬液，接种于96孔板，将不含细胞的培养基与CCK-8溶液的混合液作为空白组，每组设4个复孔，培养24、48、72、96h时避光，加10μL CCK-8检测试剂，孵育2h后用酶标仪测定每组细胞在波长450nm处的吸光度(OD值)。细胞存活率=[(实验组-空白组)/(对照组-空白组)]×100%。

1.2.5细胞克隆实验

将细胞接种在直径为35mm的培养皿中(200细胞/皿),轻晃培养皿使细胞均匀分布，置于恒温箱培养，出现肉眼可见的克隆时终止培养。4%多聚甲醛固定半小时并用PBS液进行清洗，加结晶紫染液染色半小时，用水轻轻冲洗数分钟，洗去染液，开盖晾干。拍照并计算克隆形成率：克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。

1.2.6 Transwell侵袭实验

将Matrigel胶用无血清培养液按1∶8比例进行稀释后包被Transwell小室，将细胞制成1×105细胞/mL细胞悬液，取200μL细胞悬液添加到上室中，取500μL含10%FBS的完全培养基添加到24孔板下腔室；培养24h,加PBS液浸洗，用4%多聚甲醛固定半小时，结晶紫染液染色半小时，PBS漂洗，干燥，显微镜下拍照并计数。

1.2.7划痕实验

将细胞按5×105细胞/孔接种于标记好的6孔板上，细胞汇合度达70%以上时，用20μL枪头画划痕，保证不同处理组划痕基本一致；清洗去除多余细胞，添加培养基继续培养；分别在培养0h和24h时在显微镜下拍照；测量划痕区域面积，计算细胞迁移率。

1.2.8流式细胞术检测细胞周期分布与凋亡

1.2.8.1细胞凋亡

取对数生长期细胞制成细胞悬液，离心并收集细胞；取500μL 1×Binding Buffer加至离心管中重悬细胞，加5μL Annexin V-FITC和碘化丙(PI),用移液器吹打混匀，室温避光染色30min,用流式细胞仪进行检测。

1.2.8.2细胞周期

收集细胞方法同上述；取1mL 70%乙醇固定细胞，4℃,过夜，次日离心并收集细胞；用预冷PBS液浸洗细胞，离心并收集细胞；向离心管中加500μL 1×Bingding Buffer和5μL PI染料进行染色标记，在室温且避光的条件下孵育半小时。上机前再补加200μL 1×Binding Buffer,用流式细胞仪检测细胞周期分布。

1.2.9 Western blot

取对数生长期细胞进行蛋白提取、变性、SDS-PAGE电泳、转膜，转膜完成后用5%脱脂奶粉配成的封闭液在摇床上摇动封闭2h;孵育一抗(GRB7 1∶1000;Bax 1∶1000;Bcl-2 1∶1000;Caspase 3 1∶1000;CyclinD1 1∶1000;β-actin 1∶2000),4℃过夜；用TBST液清洗3次，孵育二抗(1∶2000),室温孵育1h,用TBST液清洗3次；将PVDF膜放在化学发光仪中，滴加适量的ECL化学发光试剂，均匀铺满整张膜，利用成像系统保存图像。用Image J软件分析蛋白条带的灰度值，目标蛋白的相对表达=目标蛋白的灰度值/β-actin灰度值。

1.3统计学处理

数据采用表示，每组实验均重复至少3次；通过GraphPad Prism 9进行统计分析；两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1 LncRNA MEF2C-AS1在卵巢癌细胞中的水平

与卵巢上皮IOSE80细胞相比，卵巢癌SKOV3、OVCAR3和A2780细胞中LncRNA MEF2C-AS1水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。A2780细胞中LncRNA MEF2C-AS1水平最低(图1A),因此选择A2780细胞进行后续实验。过表达慢病毒LV-MEF2C-AS1转染A2780细胞后，与对照组相比，LncRNA MEF2C-AS1表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05),见图1B。

2.2 LncRNA MEF2C-AS1对卵巢癌A2780细胞增殖能力的影响

CCK-8实验结果显示，LV-MEF2C-AS1组A2780细胞在48h、72h和96h测得的OD值明显低于LV-NC组，差异有统计学意义(P<0.05),见图2。

2.3 LncRNA MEF2C-AS1对卵巢癌A2780细胞克隆形成能力的影响

LV-MEF2C-AS1组、LV-NC组细胞的克隆形成数分别为6044±574.10、11469.5±1794.06,LV-MEF2C-AS1组显著低于LV-NC组，差异有统计学意义(P<0.001)。

2.4 LncRNA MEF2C-AS1对卵巢癌A2780细胞迁移和侵袭能力的影响

LV-MEF2C-AS1组、LV-NC组的细胞迁移率分别为(32.66±3.93)%、(67.15±2.53)%,穿膜细胞数分别为94.71±12.56、296.71±17.90。LV-MEF2C-AS1组的细胞迁移能力和侵袭能力均显著低于LV-NC组，差异均有统计学意义(P<0.001)。

2.5 LncRNA MEF2C-AS1对卵巢癌A2780细胞凋亡及细胞周期的影响

流式细胞术结果显示，LV-MEF2C-AS1组与LV-NC组的细胞凋亡率分别为(18.47±2.77)%、(4.44±0.14)%,LV-MEF2C-AS1组显著高于LV-NC组，差异有统计学意义(P<0.001)。细胞周期结果显示，LV-MEF2C-AS1组A2780细胞处于S期和G2期的细胞百分比明显高于LV-NC组，而处于G1期的细胞百分比明显低于LV-NC组(P<0.05),见图3。

图1 RT-qPCR检测LncRNA MEF2C-AS1表达水平

图2 CCK-8检测LncRNA MEF2C-AS1对卵巢癌细胞活力的影响

2.6 LncRNA MEF2C-AS1对细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白的影响

Western blot实验结果显示，与LV-NC组相比，LV-MEF2C-AS1组Bax和Caspase 3蛋白水平显著增高，而Bcl-2和CyclinD1蛋白水平显著降低(P<0.05),见图4。

2.7 LncRNA MEF2C-AS1对GRB7表达水平的影响

卵巢癌SKOV3、OVCAR3及A2780细胞中GRB7蛋白水平明显高于卵巢上皮IOSE80细胞，A2780细胞中GRB7蛋白水平最高，差异有统计学意义(P<0.01),见图5A。LV-MEF2C-AS1组GRB7蛋白水平显著低于LV-NC组，差异有统计学意义(P<0.001),见图5B。

图3 LncRNA MEF2C-AS1对卵巢癌细胞周期分布的影响

图4 LncRNA MEF2C-AS1对卵巢癌细胞凋亡相关蛋白和周期相关蛋白水平的影响

图5 Western blot检测GRB7蛋白水平

3、讨 论

卵巢癌是妇科最致命的癌症，具有起病隐匿、病死率高的特点，大多数患者确诊时已处于中晚期，而Ⅲ期和Ⅳ期卵巢癌患者5年生存率分别为27%和13%[6]。因此，寻找卵巢癌的早期诊断方法和特异性的治疗靶点对提高卵巢癌患者的生存率至关重要。越来越多的研究表明，lncRNA在多种癌症中具有差异性，并影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化等生物学过程，在肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用[7-9]。

LncRNA MEF2C-AS1是一种新型长链非编码RNA,有研究表明LncRNA MEF2C-AS1在宫颈癌细胞中低表达，过表达MEF2C-AS1抑制宫颈癌细胞的增殖、侵袭和迁移[3,10]。在结肠癌中，LncRNA MEF2C-AS1表达降低，过表达MEF2C-AS1显著抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力[4]。本研究发现，与正常卵巢上皮细胞相比，LncRNA MEF2C-AS1在卵巢癌细胞株中表达下调，过表达LncRNA MEF2C-AS1抑制了A2780细胞的增殖、侵袭和迁移能力。因此推测LncRNA MEF2C-AS1抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移等恶性生物学行为，发挥抑癌基因的作用。为了进一步探究LncRNA MEF2C-AS1抑制卵巢癌细胞增殖的可能机制，本研究通过流式细胞术检测LncRNA MEF2C-AS1对卵巢癌A2780细胞凋亡及细胞周期分布的影响，发现过表达LncRNA MEF2C-AS1能促进卵巢癌细胞凋亡，影响卵巢癌细胞周期进展。

细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡形式，细胞凋亡受到促进或抑制都会影响肿瘤的发生和发展。Bcl-2蛋白家族的成员，在细胞凋亡过程中起关键作用，包括促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2等，促凋亡因子和抗凋亡因子的蛋白水平和相互作用是决定细胞凋亡的关键之一[11-12]。Caspase-3是细胞凋亡过程中的关键酶原，通过级联反应方式介导细胞凋亡并杀死细胞[13-14]。本研究结果显示，A2780细胞过表达LncRNA MEF2C-AS1,Bax和Caspase-3蛋白水平上调，Bcl-2蛋白水平下调，提示LncRNA MEF2C-AS1可能通过上调促凋亡蛋白Bax、Caspase-3水平，下调抗凋亡蛋白Bcl-2水平，促进卵巢癌细胞凋亡，从而发挥抑癌基因作用。CyclinD1蛋白是细胞周期重要的驱动因子，是G1到S期转变的核心参与者，在肿瘤发生发展中起着重要作用[15-16]。但本研究发现，过表达LncRNA MEF2C-AS1使卵巢癌细胞周期阻滞于S期和G2期，其作用机制需进一步研究。

GRB7是一种多功能性蛋白，是信号传导的衔接分子，通过与磷酸酪氨酸激酶及多种衔接分子相互作用调节人体各种生理和病理过程，并且影响肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制肿瘤细胞凋亡等生物学过程[17]。Wang等[18]研究发现，GRB7主要存在于卵巢癌的细胞质中，在卵巢癌细胞中上调，过表达GRB7促进卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。本课题组前期通过生物信息学分析发现，LncRNA MEF2C-AS1表达水平与GRB7表达水平呈负相关[5]。本研究通过Western blot检测GRB7在卵巢上皮IOSE80细胞、卵巢癌SKOV3、OVCAR3和A2780细胞中的表达水平，结果与既往研究一致，GRB7在SKOV3、OVCAR3及A2780细胞中均显著上调。而过表达LncRNA MEF2C-AS1能显著降低卵巢癌A2780细胞中GRB7蛋白水平，提示LncRNA MEF2C-AS1可能通过下调GRB7表达抑制卵巢癌细胞的恶性生物学行为。

综上所述，LncRNA MEF2C-AS1可抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移，促进卵巢癌细胞凋亡，影响细胞周期进展。LncRNA MEF2C-AS1可能通过下调GRB7表达影响其介导的信号传导抑制卵巢癌细胞的恶性生物学行为。本研究探讨了LncRNA MEF2C-AS1在卵巢癌中的生物学功能，为LncRNA MEF2C-AS1作为卵巢癌诊断、治疗及预后监测的潜在靶点提供了理论依据和实验基础。

参考文献:

[5]杨艳.基于生物信息学卵巢癌中差异LncRNAs-DEGs表达模式分析[D].昆明医科大学,2019

基金资助:国家自然科学地区科学基金(No:82360579); 2019年度云南省“万人计划”名医专项(No:YNWR-MY-2019-037);云南省科技厅-昆医联合专项重点项目(No:202401AY070001-053);昆明医科大学第二附属医院对外合作项目(No:2022dwhz06);

文章来源:邹丹,邓玥,董莹,等.LncRNA MEF2C-AS1对卵巢癌生物学功能的影响及机制研究[J].现代妇产科进展,2024,33(11):801-805.