文题释义：

3D打印多孔钛合金支架：指以数字模型文件为基础，利用激光或电子束熔融钛合金粉末，通过“分层制造、逐层叠加”的方式快速制造出具有某种多孔结构的钛合金材料。该方法能精确控制其内部结构和外部形状，具有快速、精准、智能、个性化制造的特点。

骨整合：指在光学显微镜下植入体与周围骨组织之间无纤维结缔组织的直接接触，又称骨性结合、骨融合，这种骨性结构由于将植入体与组织连接成为一个整体，可有效分散应力，增强植入体的稳固性。

引言Introduction

自体骨移植被视为骨缺损修复的金标准，但因取骨量有限及增加创伤、供区疼痛、出血等并发症而受限制[1]。同种异体骨供应量丰富，但存在免疫原性及传染疾病的风险[2]。脱钙骨及含钙磷无机人工骨则过于松脆，强度及韧性低，不适用于大段骨缺损。近年来装载干细胞和骨生长因子的复合多孔骨组织工程材料成为研究热点，如丝素蛋白、复合聚乙烯醇、壳聚糖等，为难治性骨缺损提供了极富前景的治疗选择。CUI等[3]设计了一种新型的聚乳酸-乙醇酸/羟基磷灰石/聚(L-乳酸)-苯胺五聚体/人骨形态发生蛋白4支架，它可将人骨形态发生蛋白4有效整合到具有电活性的骨修复材料中，借助兔桡骨缺损模型证明了其能促进细胞增殖和成骨分化，也提高了骨缺损修复的有效性。但目前高分子支架材料的机械强度仍难以胜任负重及扭矩要求高的下肢大段骨缺损，如何同时兼顾骨修复材料的机械强度和成骨能力目前仍是一大难题。

医用钛合金(Ti6Al4V)因其良好的生物相容性、可靠的机械性能和耐腐蚀性被广泛用来制造骨科内植物[4,5,6,7]，但其远高于骨组织的弹性模量会产生明显的应力遮挡，长期植入后易导致骨组织因受力减少而发生骨质疏松和内植物松动[8,9,10]。近年来随着金属3D打印多孔钛合金技术的迅猛发展，在保证足够机械强度的前提下多孔结构能有效降低材料弹性模量，而且其微孔结构有利于新生骨长入，使其形成牢固的机械锁结，极大提高了植入物的长期稳定性[11]，因此也为大段骨缺损的修复提供了崭新方法[12]。

多孔钛合金的微孔结构能为成骨细胞的增殖与迁移提供充分的空间，也对间充质干细胞的成血管作用有着促进作用[13]；孔径还影响成骨基因的表达和成骨细胞的分化，是骨整合的重要因素，但是多大的孔径最有利于新生骨的长入尚存在争议[14,15,16,17]。一些研究报道，植入物孔径为100-400μm时可通过促进血管生成和骨传导而有益于骨形成，低于此范围的孔径会限制骨细胞(50-70μm)的向内生长[18,19,20]。对于大孔径植入物的研究，刘邦定等[21]发现孔径在2000μm及3000μm时孔隙中心空洞基本无骨质形成，而1000μm孔径内的新生骨形成较多，这说明孔径并非越大越好，1000μm可能是一个上限。值得注意的是，早期多孔植入物的制造大多采用相分离[22]、致孔剂浸出和气体发泡等传统制造技术[23,24]，其共同缺陷是微孔大小差别大，难以准确评价不同孔径对新生骨形成的影响。因此，目前对于骨整合的最佳孔径仍不清楚，寻找最适孔径获得最佳骨长入仍具重要意义。近年来随着金属3D打印技术的快速发展，电子束熔融技术能精确控制孔径、孔隙率、微孔形状等重要结构参数，快速打印多孔钛合金支架，为解决这一问题提供了良好契机[25,26,27]。因此，实验在以往研究的基础上，应用最新的电子束熔融3D打印技术制备孔径分别约为200,600,1000μm的多孔钛合金支架植入物，采用新西兰兔股骨外侧髁骨缺损修复模型探索不同孔径对骨形成的影响。

1、材料和方法Materialsandmethods

1.1设计

随机对照动物实验。

1.2时间及地点

于2019年1月至2020年5月在苏州大学骨科研究所完成。

1.3材料

1.3.1实验动物

3月龄健康雄性新西兰大白兔20只，普通级，体质量2.0-2.2kg，购于苏州大学动物实验中心，许可证号：SYXK(苏)2014-0029，合格证号：201829792，自由摄食和饮水。

1.3.2实验仪器及用品

小动物数字化X射线成像系统(SedecalSPL-HF-VET-4.0，西班牙)；小动物断层扫描系统(SkyScan1176In-VivoMicro-CT,Belgium)；光学显微镜(ZEISSImageM1，德国)；微机控制电子万能材料试验机(HY-108010000N，中国)；骨科手术器械(张家港金鹿医疗器械有限公司，中国)；3D打印多孔钛合金支架(北京爱康宜诚医疗器械有限公司，中国)；甲苯胺蓝染色剂(南京建成生物工程研究所，中国)；戊巴比妥钠(Sigma公司，美国)；注射用青霉素(北京中杉金桥有限公司，中国)。

1.3.3多孔钛合金植入物

多孔钛合金植入物由北京爱康宜诚医疗器械有限公司制备和提供。首先采用计算机辅助设计技术构建3种不同的三维圆柱体模型，3种模型均为表层多孔(厚度1.5mm)内部为实体的圆柱体样，其直径为10mm、高为5mm。3种模型的不同之处仅在于孔径大小不同，孔径分别为200,600,1000μm。然后将其输入3D金属打印系统中，以Ti-6Al-4V粉末为原材料进行打印，随后逐层熔融凝固而成。经检测3组植入物的平均孔径及孔隙率分别为203.2μm、49.7%,604.6μm、62.7%,1054.5μm、73.4%。为同时对比微孔和无孔面的骨黏附能力并真实地模拟临床，特采用线切割将圆柱体纵切为4等分的扇柱体(图1)，半径为5mm、高度为5mm，上下两扇形面及侧方弧形面均为多孔粗糙面，侧方切面中央为矩形无孔光面。植入实验动物体内前超声震荡清洗，采用高温高压蒸汽灭菌。

1.4方法

1.4.1多孔钛合金植入物力学强度的测定

利用微机控制电子万能材料试验机对3组植入物以1mm/min的速度进行轴向压缩实验，根据力值与形变曲线得到压缩时材料的屈服强度和极限强度，每组测定3个样品以获得机械参数的平均值。

1.4.2动物实验

将20只新西兰兔40条后腿随机分为A、B、C、D组，每组10条腿。采用体积分数3%戊巴比妥钠(30mg/kg)经耳缘静脉注射麻醉20只兔，将动物侧卧位固定于手术台上，碘伏消毒手术区域，铺洞巾，取股骨外髁纵行切口，长约2cm，纵行逐层切开并分离皮肤、筋膜、肌肉、骨膜，显露股骨外侧髁，用骨刀在股骨外髁处凿开正方形骨窗，边长5mm,A、B、C组分别植入200,600,1000μm孔径的多孔钛合金实验支架，植入体的正方形切面朝外，略低于骨缺损表面(图2)，确认其位置和稳定性后缝合关闭切口；D组仅做骨缺损，不放植入物。各组兔术后连续3d肌肉注射青霉素钠160×104U/d预防感染。术后4,8周拍摄X射线片；术后8周时，采用过量戊巴比妥钠处死所有实验动物，取下兔股骨并清除周围软组织后进行后续实验。

1.5主要观察指标

大体观察：术后定期观察实验动物的饮食、活动情况及手术切口有无红肿、渗液等感染迹象。术后8周处死兔取股骨标本，观察各组骨缺损愈合情况，有无周围组织包绕、纤维组织溶解及坏死，观察植入物表面新生骨的形成情况。

X射线片观察：术后4,8周时，使用小动物数字化X射线成像系统拍摄实验动物双侧后肢X射线侧位片，观察植入物有无移位、脱出，以及植入物周围是否存在骨溶解、骨坏死等现象。

Micro-CT检测：术后8周，利用Micro-CT扫描各组兔股骨标本并进行三维重建，电压80kV，电流300μA，曝光时间290ms。在每个标本弧形面的表层多孔支架结构中，选取长2.3mm、宽1.3mm的矩形，250层为感兴趣区域(其中像素设置为18μm)，并使用配套软件CTAnalyser(Version:1.16.4.1)分别定量分析A、B、C组感兴趣区域的骨小梁生长参数：(1)骨小梁相对体积；(2)骨小梁数量；(3)骨小梁厚度；(4)骨小梁分离度：骨小梁之间的平均距离，其值越大说明骨结构越差；(5)骨表面积密度：又称为骨表面积组织体积比值，可以间接反映骨量多少。

组织学观察：A、B、C组随机选取一兔股骨标本依次行40g/L多聚甲醛液固定，梯度浓度乙醇脱水，甲基丙烯酸甲酯包埋，硬组织切片机切片(在植入物纵轴的中央位置，沿着与其纵轴相垂直的方向切割)，甲苯胺蓝染色，最后在光学显微镜下采集图像，观察新生骨组织在多孔钛合金材料周围及孔隙中的生成情况。

1.6统计学分析

所有计量资料均采用表示，应用GraphPadPrism8统计学软件进行单因素方差分析和Tukey的多重比较检验，P<0.05时差异有显著性意义。

2、结果Results

2.1多孔钛合金植入物的机械性能

A、B、C组植入物的平均屈服强度分别为(98.1±3.0),(16.1±2.3),(7.5±1.0)MPa，平均极限强度分别为(447.1±9.8),(327.3±12.6),(272.4±20.2)MPa，如图3所示。可见随着孔径和孔隙率的增大，多孔植入物的屈服强度和极限强度都明显减小，且3组之间屈服强度和极限强度比较差异均有显著性意义(P<0.05)。

2.2实验动物一般情况及数量分析

各组兔术后3d的饮食稍差，双侧后肢活动较少，伤口闭合良好。3d后，各组兔饮食、活动逐渐恢复正常，伤口无红肿、渗液，伤口愈合良好。20只兔均正常存活，无死亡。

2.3各组大体观察结果

术后8周取材，可见A、B、C组植入物均与周围骨组织紧密结合，骨缺损边界模糊不清，未见明显周围组织溶解、坏死；D组可见骨缺损处较周围骨质明显凹陷，骨缺损边界仍清晰，缺损中央为纤维瘢痕组织填充，质较软，未完全修复(图4)。取出材料后，可见植入支架多孔表面不同程度地均有新生骨长入，无孔切面上也有较多新生骨黏附，但易去除(图5)。

2.4各组X射线片观察结果

术后4,8周X射线片显示，A-C组内植物位置良好，未见明显移位和脱落，材料周围骨形成良好，未见骨溶解、骨坏死等现象，见图6。

2.5各组Micro-CT检测结果

采用Micro-CT扫描各组兔股骨标本植入物的二维平扫面及三维重建图，见图7,8。可见3组植入物的孔隙内及植入物周围均不同程度地有组织存在。3组微孔内骨小梁生长参数结果，见表1。B组微孔的骨小梁数量及骨表面积密度高于A、C组(P<0.05),A组微孔的骨小梁厚度大于B、C组(P<0.05)，其余指标组间两两比较差异均无显著性意义(P>0.05)。

表1|术后8周时各组植入物的Micro-CT分析结果

2.6各组组织学观察结果

将A、B、C组的硬组织切片行甲苯胺蓝染色，紫色代表新生骨组织，在光学显微镜下采集图像，见图9所示，B组几乎所有表层微孔内均有新生骨组织长入，部分新生骨延伸进入实验支架的深层孔隙中，与多孔结构结合紧密，形成机械交锁；A、C组仅有少量表层微孔存在新生骨组织长入，深层孔隙无明显的新生骨质形成，新生骨与植入物结合较差。

3、讨论Discussion

理想的3D打印支架应具有类似于健康骨骼组织的多孔结构，为细胞迁移和新生骨组织长入提供合适的微孔结构，包括孔隙率、孔径等[28]。由于正常人体松质骨孔隙率为50%-95%[29]，而此次实验中3组多孔植入物的孔隙率分别为49.7%,62.7%,73.4%，与正常人松质骨孔隙率一致，因而能够更好地促进细胞的迁移和新生骨组织长入。此外，ZHU等[29]认为过大的孔径和孔隙率会损伤支架材料结构的整体性能，导致材料的机械强度减小。当载荷超过材料的屈服强度时将使其产生塑性变形，当载荷使其所受应力超过极限强度时则产生破裂。此次实验中3组植入物的平均屈服强度与极限强度均随着孔径和孔隙率增大而明显减小，且3组之间比较差异有显著性意义(P<0.05)，符合之前的研究；并且3组植入物的屈服强度均高于正常人体松质骨(2-12MPa[30])，极限强度也均远大于健康人体皮质骨的极限强度(115.6-180.8MPa[31])。因此，实验中的3D打印多孔钛合金支架具备足够的力学强度应用于骨缺损修复。

值得一提的是，实验采用扇柱体构型的支架是为了更好地模拟临床，因为多孔内植物往往无需所有表面均要求骨长入，比如生物型股骨假体干骺端需制备微孔层以促进骨整合，而假体远端无需多孔层，甚至需抛光以避免骨长入和对股骨近端的应力遮挡。另外，3D打印钛合金无孔面是否也具有良好的骨黏附能力尚无直接实验证据，因此采用了兼具多孔和无孔面的扇柱体支架进行实验。

众所周知，具有良好的生物相容性是骨整合的前提条件。医用钛合金(Ti6Al4V)的安全性已被临床长期应用证实对人体无害[32,33,34]。课题组采用电子束熔融3D打印技术在高温下熔融钛合金粉末(Ti6Al4V)，逐层堆积制备了不同孔径的多孔钛合金支架，同样具有优异的生物相容性[30]。此次实验所有宿主动物均正常存活，植入物未发生明显腐蚀，周围未发生明显骨溶解、骨坏死，术后8周取出的实验组支架各表面(包括多孔和无孔切面)均有不同程度的新生骨长入和骨黏附，表明3D打印多孔钛合金支架具有良好的生物相容性，满足骨科植入物的前体条件。

Micro-CT是分析多孔植入物骨整合情况的无创、有效方法[35]。以往研究大多仅采用骨小梁相对体积来反映新骨形成的差异性，评价指标过于单一，此次实验采用5组骨小梁生长参数(骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁相对体积、骨表面积密度、骨小梁分离度)全面评价不同孔径对孔隙内骨小梁生长情况的影响，相比传统单一的评价更具准确性[36]。实验结果显示，术后8周时200μm孔径组骨小梁厚度明显高于600,1000μm孔径组(P<0.05)，而骨小梁数目为3组中最低，说明较小的孔径可能更适合成骨细胞对孔壁结构的黏附，因此有利于骨小梁的变厚。但较小的孔径和孔隙率限制了其渗透性，阻碍养分和代谢废物的交换[37]，不利于成骨细胞的增殖与分化，因此骨小梁数目形成减少、成骨不良影响新生骨形成[38,39]。多项研究也揭示，成骨细胞通常不会直接分布在小于200μm的间隙中，大于300µm的孔径有助于营养物质和氧气渗透到内部孔隙中并促进血管形成[15,18]。实验结果显示，600μm组含有最高的骨小梁相对体积、最多的骨小梁数目(P<0.05)与骨表面积密度(P<0.05)和最小的骨小梁分离度，说明适中的孔径更利于营养成分运输并滋养组织细胞，促进成骨细胞的增殖与分化，形成更多的骨小梁数目和新生骨组织，同时骨质量也更好；1000μm组骨小梁相对体积为3组中最低，骨小梁分离度为3组中最高，分析为可能是：过大的孔径使得成骨细胞缺乏材料孔隙的支架作用，难以黏附于孔壁，所形成的骨小梁分离度也很大，骨小梁结构差[15]，但这仍需进一步的细胞学实验研究加以证实。PRANANINGRUM等[40]认为在大孔径支架中，由于新生骨组织在孔隙结构中所占体积比相对较小，在初期成骨阶段不能保证“骨-支架界面”的连接稳定性，从而导致了新骨形成受阻。

另外，组织学检查是研究多孔植入物周围区域及孔隙内新生骨组织形态的直接方法。此次实验经甲苯胺蓝染色的硬组织切片发现，600μm孔径组其新生骨组织长入孔隙的范围和深度及与植入物的结合强度均明显优于另外两组，更有利于骨整合，这也印证了Micro-CT的实验结果。此次实验结果也获得了其他一些研究支持，比如OUYANG等[7]比较了选择性激光熔融制备的具有相似孔隙率和不同孔径(400,650,850和1100μm)多孔钛支架的骨长入性能，发现650μm孔径具有最佳的骨长入；TANIGUCHI等[41]比较了选择性激光熔融技术制作的300,600,900μm孔径对骨长入的影响，发现600μm孔径的多孔钛合金最适于制作骨科植入物；FUKUDA等[42]比较了500,600,900,1200μm多孔植入体的体内成骨能力，发现500,600μm孔径具有更佳的骨引导作用。此次实验结果与上述学者得出的600μm左右孔径更利于骨整合这一观点相符。也有研究报道认为最适宜的孔径在100-500μm之间，作者认为造成这种差别的原因主要还是因为各个学者所制备的多孔植入物其他结构参数比如孔隙率的不同有关。

图1|多孔钛合金植入物实物图

图2|多孔钛合金材料植入兔股骨外侧髁示意图

图3|不同孔径多孔植入物的屈服强度与极限强度

图4|术后8周各组股骨标本大体观察

图5|术后8周各组植入物大体观察

图6|术后不同时间点各组兔后肢侧位X射线片观察

图7|术后8周时各组股骨标本Micro-CT扫描2D图像

图8|术后8周时各组植入物Micro-CT扫描3D图像

图9|术后8周时各组材料组织学切片(甲苯胺蓝染色，×25)

实验存在两点不足：第一，实验动物饲养8周时间较短，缺少更长期的研究跟进和对比；第二，只做了兔体内实验，尚未做体外实验，未能进一步从细胞、基因水平来分析研究孔径对新骨形成的影响，这也是课题需完善和继续深入研究的方向，以期获得更为准确、全面、客观的研究结果。

综上所述，实验结果表明，3D打印多孔钛合金具有良好的生物相容性，孔径大小会影响材料的机械性能与骨整合能力，600μm左右的孔径更有利于微孔内新骨形成。此次实验可以为骨缺损修复填充块、3D打印人工股骨假体等骨科植入物的孔隙尺寸设计提供一定的参考。

作者贡献：实验设计为第一、三、五作者，实验实施为一、二、三、四、五作者，实验评估为第三、五作者，资料收集为第一、四、六、七、八作者。

经费支持：该文章接受了“国家自然科学面上基金项目(61772172)及常州市卫计委重大项目(ZD201617)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。

机构伦理问题：实验方案经苏州大学动物实验伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。

写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。

文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

生物统计学声明：该文统计学方法已经大连医科大学生物统计学专家审核。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。

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基金:国家自然科学面上基金资助项目(61772172),项目参与者:蒋俊锋､刘宏伟;常州市卫计委重大项目资助(ZD201617),项目负责人:刘宏伟