文题释义：

氧化石墨烯：是高度亲水的材料，并提供pH依赖性的负表面电荷和胶体稳定性，具有比其他碳基纳米材料更高的表面积和独特的两亲性表面特性，可以通过非共价相互作用吸附蛋白质、染料分子和水不溶性药物，在组织工程、药物释放、生物传感器等方面具有巨大的运用潜力。

静电纺丝：是一种使用喷涂溶液或熔体在强电场作用下制备超细纤维的方法。静电纺丝设备一般由3部分组成：推注装置、高压电源和收集装置，推注装置和收集装置之间的强静电场使液体形成射流，射流在电场中被拉伸，导致收集装置上微纳米尺度的纤维沉积。

缩略语：蛋清/聚乙烯醇/氧化石墨烯：eggwhite/polyvinylalcohol/grapheneoxide,EW/PVA/GO

引言Introduction

由创伤、肿瘤切除、感染和先天缺陷等造成的骨缺损仍然是一个临床挑战[1]。骨组织工程的快速发展为修复骨缺损开辟了新途径，骨组织工程旨在开发一种可行的、有功能性的人工移植骨，帮助修复和再生骨缺损。血管在骨修复过程中起着至关重要的作用，它不仅是营养物质扩散、细胞增殖和新生骨组织生长的营养传递器官，而且在调节骨再生过程中所涉及的细胞和信号分子等方面起着关键作用。血管化是骨生长发育的关键过程，目前血管化依然是骨组织工程的主要挑战之一[2,3]。支架作为骨组织工程的重要基础之一，其主要作用不仅是为细胞提供一个生长环境，而且在骨重建过程中起着细胞引导作用，以促进细胞增殖、迁移等，因此寻找理想的支架是骨组织工程的关键之一。

因为人体组织和器官高度的复杂性，所以对组织工程支架的要求也是多方面的。利用材料间不同的优势，将具有不同特性的材料复合构建理想的组织工程支架，是当前组织工程支架构建的主要研究方向之一[4]。鸡蛋清作为一种优良的天然蛋白质来源包含人体所需的所有必需氨基酸和维生素[5]，其作为天然产物具有低免疫原性并能促进细胞的增殖及黏附，具有较好的生物相容性，并有一定促进血管生成作用[6]；然而鸡蛋清中的蛋白分子结构导致其抗拉强度较低、可纺丝性差等局限了其在再生材料中的运用[7]。利用静电纺丝制备的纤维支架具有孔径小、纤度细、比表面积大等优点，是一种理想的组织工程支架[8]。聚乙烯醇具有较好的生物相容性和可纺性[9]，故聚乙烯醇复合鸡蛋清后可能会提高鸡蛋清的可纺性而形成纤维支架；但是由于聚乙烯醇的官能团和细胞识别位点不足，其细胞相容性等生物活性还有进一步提高的空间[10]。氧化石墨烯作为一种多功能材料具有较大表面积、丰富官能团[11]，相关研究表明，适量的氧化石墨烯添加可以改善纤维支架的机械性能、亲水性、细胞相容性，并有一定促进成骨性能，然而过高的氧化石墨烯会产生细胞毒性[12,13,14]。因此，为了更有效地促进骨组织的再生，有必要寻找合适的氧化石墨烯浓度来修饰鸡蛋清/聚乙烯醇纤维支架。

目前还没有关于氧化石墨烯和鸡蛋清/聚乙烯醇结合作为组织工程支架的具体报道。因为氧化石墨烯和鸡蛋清在组织工程中优异的材料特性，所以实验采用静电纺丝法首次制备了不同氧化石墨烯含量的蛋清/聚乙烯醇/氧化石墨烯(eggwhite/polyvinylalcohol/grapheneoxide,EW/PVA/GO)组织工程支架，并对纤维支架进行表征和细胞相容性方面的评估，以得到一种有潜在研究价值的骨组织工程支架。

1、材料和方法Materialsandmethods

1.1设计

体外观察实验。

1.2时间及地点

实验于2019年5月至2020年1月在贵州医科大学组织工程与干细胞实验室完成。

1.3材料

人骨髓间充质干细胞来源于贵州医科大学附属医院，所有供者对实验知情同意；人脐静脉血管内皮细胞来自美国模式培养物集存库(ATCC)。高活性氧化石墨烯、蛋清、聚乙烯醇理化性能介绍，见表1。

表1|高活性氧化石墨烯、蛋清、聚乙烯醇理化性能介绍

实验用主要试剂及仪器：静电纺丝机(SS-2534H，北京永康乐业科技发展有限公司，中国)；罗丹明标记鬼笔环肽、DAPI染色液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)(北京索莱宝)；Live/dead染色液(北京百奥莱博)；CCK-8试剂(日本同仁)；DMEM(Gibco,USA)；体视显微镜(SMZ745T,Nikon,Japan)；激光共聚焦显微镜LSM5Excitor(CarlZeiss)；扫描电镜(Hitachi，日本)；多功能酶标仪(SpectraMaxM5,MolecularDevices,Sunnyvale,CA)；电子万能试验机(QJ210A，上海倾技)；高压电源供电装置(SS-2534H，北京永康乐业)。

1.4实验方法

1.4.1电纺EW/PVA/GO纤维支架的制备

将氧化石墨烯粉末在双蒸水中超声分散2h，制成梯度质量浓度分别为0,2,4,6g/L的悬浮液。鸡蛋清从新鲜鸡蛋中取出并与蛋黄分离，磁力搅拌器搅拌至少1h，得到均匀的蛋清溶液。将聚乙烯醇溶于双蒸水中加热至85℃搅拌2h，制成140g/L的均匀聚乙烯醇溶液。将不同浓度的氧化石墨烯水溶液和鸡蛋清溶液1∶1均匀混合，最后将所得的氧化石墨烯/鸡蛋清混合溶液与聚乙烯醇溶液1∶1混合并搅拌均匀，最终得到氧化石墨烯梯度质量浓度为0,0.5,1,1.5g/L的EW/PVA/GO的均质悬浮液。

将制备好的悬浮液放入装有20G钝化不锈钢针的5mL注射器中。在静电纺丝过程中，高压电源供电装置(SS-2534H，北京永康乐业)设置电压正极22kV、负极2kV，接收距离20-25cm，溶液推注速度0.1mm/min。取0.3834g的EDC·HCl溶解于1L无水乙醇中搅拌，得到2mmol/L的EDC无水乙醇。最后，将电纺所得的支架浸入含2mmol/L的EDC无水乙醇中进行交联，24h后取出并在37℃循环干燥空气中过夜干燥。

1.4.2支架形貌表征

电纺后，用体视显微镜对不同纤维支架的大体形貌进行观察；采用扫描电子显微镜对交联后纤维支架的形貌进行表征，分析其形貌及纤维直径分布，所有样品扫描前进行喷金处理，采集后的图像利用ImageJ软件计算纤维直径分布(n=50)。纤维被喷到一个铜网格上以作进一步的分析，运用透射电镜(JEM-1400plus)观察纤维上的氧化石墨烯结构。

1.4.3支架亲水性测试

通过接触角和溶胀比评价4组纤维支架的亲水性。简单地说，在交联后支架(2cm×2cm)上滴一滴水，测量水滴与支架间的接触角并记录图像，每秒拍摄6张，根据水滴与支架的夹角评估其亲水性。通过将干燥的支架切成小块(1cm×1cm)，称量干燥支架质量(md)，然后将其浸入37℃的PBS中，进行溶胀比测定。以特定的时间间隔从PBS中取出支架，并立即测定支架的湿质量(mw)。用公式计算支架的溶胀比：溶胀比(%)=(mw-md)/md×100%。

1.4.4支架力学测试

将4组纤维支架分别裁成25mm×10mm大小，其有效拉伸长度为10mm；用电子万能试验机行拉伸实验，使用200N传感器，拉伸速度为1mm/min，得到应力应变曲线，计算杨氏模量和拉伸强度(n=3)。

1.4.5细胞的提取与培养

人脐静脉血管内皮细胞培养：将人脐静脉血管内皮细胞在含体积分数10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的高糖DMEM培养基中培养，置于37℃、体积分数5%CO2浓度的培养箱中，培养基每3d更换一次。

人骨髓间充质干细胞的提取及培养：从人骨髓中分离出骨髓间充质干细胞，在知情同意下从接受手术的患者中收集骨髓抽吸液。将抽吸液以1500r/s离心5min，去除上清液，以1∶1的比例重悬于含体积分数10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM培养基中，然后将其以2×1010L-1的细胞浓度接种于细胞培养瓶中，并置于37℃、体积分数5%CO2的培养箱中。每3d更换一次培养基，当细胞达到80%融合时进行细胞传代。选取第3代细胞用于以下实验。

1.4.6细胞增殖检测

将4组支架裁剪为24孔板大小，经60Co灭菌后置于24孔板内。将人脐静脉血管内皮细胞和人骨髓间充质干细胞分别按3×103/孔的密度接种于4组纤维支架上。每组分别取4孔，于第1,3,5,7天检测前每孔加入CCK-8试剂50µL，培养箱中孵育2h，然后每孔吸100µL培养液放入96孔板中，于450nm处测定每孔吸光度值。

1.4.7Live/Dead染色观察细胞死活

将人脐静脉血管内皮细胞和人骨髓间充质干细胞分别按3×104/孔的密度接种于4组支架。培养7d后加入配置好的活死染色液，25℃下孵育1h，利用激光共聚焦显微镜进行图片采集，绿色为活细胞，红色为死细胞。

1.4.8人脐静脉血管内皮细胞迁移检测

4组支架消毒后于2mL无血清的DMEM浸泡72h。同时人脐静脉血管内皮细胞在6孔板中培养至形成单层细胞，用200µL移液管尖端在细胞层表面划痕形成无细胞区域，PBS漂洗后将各组支架浸提液加入孔板，置入37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。在0,12h用光学显微镜观察细胞在划痕区域的迁移。

1.4.9人脐静脉血管内皮细胞形态观察

用激光共聚焦显微镜观察人脐静脉血管内皮细胞培养12h后在支架上的微丝和细胞骨架。将固定后的细胞-支架复合物在0.5%Triton-X100溶液中孵育30min进行细胞破膜，破膜后的细胞-支架复合物在罗丹明-鬼笔环肽中孵育2h，最后将样品在DAPI孵育7min，激光共聚焦显微镜下检查样品。

1.5主要观察指标

不同氧化石墨烯含量EW/PVA/GO纤维支架的微观结构、力学性能、接触角、溶胀比及细胞相容性。

1.6统计学分析

实验数据均使用SPSS22.0软件进行统计分析，数据结果均以表示，各平行组间差异采用单因素方差分析来比较。P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果Results

2.1各组支架的形态

宏观结构可见，添加了氧化石墨烯的纤维支架相对于未添加组的颜色变深。氧化石墨烯含量为0,0.5,1g/L的复合支架表面均匀，而氧化石墨烯含量为1.5g/L的复合支架表面粗糙，见图1A。扫描电镜可见，各组支架呈现出随机的纤维形态和相互连接的多孔结构，见图1B。未添加氧化石墨烯复合支架的纤维直径为(232±21)nm，随着氧化石墨烯含量增加复合支架纤维直径增大，分别为(254±27),(266±29),(281±20)nm，见图1C。选择氧化石墨烯为1.5g/L的复合支架纤维进行透射电镜观察，可见氧化石墨烯与纤维相结合。

2.2各组支架的亲水性能

未添加氧化石墨烯复合支架的接触角为(38.4±1.13)°，随着氧化石墨烯含量的增加，复合支架的接触角分别为(63.32±0.77)°，(57.76±1.16)°，(53.16±1.53)°，4组接触角比较差异有显著性意义(P<0.05)，见图2A；未添加氧化石墨烯复合支架的平衡溶胀比为(236.6±3.5)%，随着氧化石墨烯含量的增加，复合支架的平衡溶胀比分别为(208.9±4.1)%,(217.6±2.1)%,(220.5±3.3)%，与未添加氧化石墨烯组相比差异有显著性意义(P<0.05)，见图2B；可见接触角先增大后减小，平衡溶胀比先减小后增大，支架亲水性先降低后增高。

2.3各组支架的机械性能测定

4组支架的应力-应变曲线如图3所示，通过5%-20%应力-应变曲线的斜率计算杨氏模量。未添加氧化石墨烯复合支架杨氏模量和拉伸强度分别为(2.04±0.21),(8.18±1.02)MPa，随着氧化石墨烯含量的增加，复合支架的杨氏模量分别为(4.73±0.12),(4.31±0.14),(3.21±0.19)MPa，拉伸强度分别为(15.75±1.12),(12.48±0.87),(9.97±0.96)MPa,4组复合支架的杨氏模量、拉伸强度比较差异有显著性意义(P<0.05)，见表2。4组纤维支架的杨氏模量和拉伸强度先增大后减小，其中氧化石墨烯含量为0.5,1g/L复合支架的杨氏模量和拉伸强度较大，具有较优的力学性能。

2.4各组复合支架中的细胞增殖检测结果

随着培养时间的延长，2种细胞在各组复合支架中的增殖均呈递增趋势；培养1-3d时，4组支架的细胞增殖速率无明显差异(P>0.05)；培养5-7d时，骨髓间充质干细胞增殖速率随复合支架中氧化石墨烯含量的增加而增快，氧化石墨烯含量为1.5g/L复合支架组最快，与其他组相比差异有显著性意义(P<0.05)，见图4A；培养5-7d时，氧化石墨烯含量为1g/L复合支架组的人脐静脉血管内皮细胞增殖速率最快，与其他组相比差异有显著性意义(P<0.05)；有趣的是，氧化石墨烯含量为1.5g/L复合支架组的人脐静脉血管内皮细胞增殖速率最慢，与其他组相比差异有显著性意义(P<0.05)，见图4B。

表2|不同氧化石墨烯含量的蛋清/聚乙烯醇/氧化石墨烯复合支架的机械性能比较

2.5各组复合支架上细胞Live/Dead荧光染色结果

人骨髓间充质干细胞和人脐静脉血管内皮细胞分别复合4组支架培养7d后，可见各组均散布大多数绿色荧光细胞(活细胞)和少量的红色荧光细胞(死细胞)，见图5A、B。

人骨髓间充质干细胞在氧化石墨烯含量为0,0.5,1,1.5g/LEW/PVA/GO复合支架中的细胞存活率分别为(86.20±0.86)%,(90.1±1.143)%,(95.20±1.157)%,(96.76±1.89)%，氧化石墨烯含量为1g/L和1.5g/L复合支架组人骨髓间充质干细胞存活率比较差异无显著性意义(P>0.05)，但该两组与其他组比较差异有显著性意义(P<0.05)，见图5C。人脐静脉血管内皮细胞在氧化石墨烯含量为0,0.5,1,1.5g/LEW/PVA/GO复合支架中的细胞存活率分别为(90.02±1.3)%,(91.65±1.21)%,(96.63±1.23)%,(84.13±1.55)%，氧化石墨烯含量为1g/L复合支架组的人脐静脉血管内皮细胞存活率最高，1.5g/L复合支架组最低，与0g/L复合支架组比较差异有显著性意义(P<0.05)，见图5D。

2.6各组复合支架上人脐静脉血管内皮细胞形态及迁移测定

12h内人脐静脉血管内皮细胞在支架浸提液中能迁移至划痕区域，并覆盖划痕区域，见图6A。进一步计算划痕愈合率，氧化石墨烯含量为0,0.5,1,1.5g/LEW/PVA/GO复合支架组的愈合率分别为(68.85±2.81)%,(78.17±1.17)%,(90.20±2.12)%,(37.69±2.86)%，见图6B。氧化石墨烯含量为1g/L复合支架组愈合率最高，氧化石墨烯含量为1.5g/L复合支架组愈合率最低，与0g/L复合支架组比较差异有显著性意义(P<0.05)。

为了进一步评估细胞形态对人脐静脉血管内皮细胞迁移影响，通过激光共聚焦显微镜对人脐静脉血管内皮细胞在各组复合支架上的形貌进行表征，肌动蛋白细胞骨架被鬼笔环肽染成红色，细胞核被DAPI染成蓝色。迁移的人脐静脉血管内皮细胞能保持其多角形的原始形态，氧化石墨烯含量为1g/L复合支架组的人脐静脉血管内皮细胞形态扩张最明显，而氧化石墨烯含量为1.5g/L复合支架组的形态扩张最差，见图6C。

3、讨论Discussion

氧化石墨烯虽然对人体具有一定的毒性作用，但由于良好的材料学特性使其在再生医学领域得到了广泛运用。氧化石墨烯具有一定的毒性积累效应，高浓度的氧化石墨烯会对人体产生较大的毒性作用；低浓度的氧化石墨烯在人体内可通过消化道、肾脏等进行代谢及清除，然而高浓度的氧化石墨烯往往会在人体内大量聚集且难以被代谢及清除，对人体产生的毒性作用也会逐渐增加，因此寻找到合适的氧化石墨烯浓度以促进骨组织再生并降低氧化石墨烯所带来的毒性作用是十分重要的[15]。

实验证实，氧化石墨烯含量为1g/L的EW/PVA/GO复合纤维支架具有良好的纤维结构、亲水性、力学性能，可促进细胞增殖、黏附及迁移扩散，具有较优的体外生物相容性。透射电镜结果可见，氧化石墨烯成功地与鸡蛋清/聚乙烯醇纤维结合。与鸡蛋清/聚乙烯醇纤维支架相比，随着氧化石墨烯含量的增加复合支架纤维的直径逐渐增大，这可能是氧化石墨烯丰富的氧化官能团使电纺溶液的黏度增大和电导率降低所致[16]。随着氧化石墨烯含量的增加，复合支架的亲水性先降低后增高。亲水性降低是由于氧化石墨烯上的-COOH和-OH等亲水基团与鸡蛋清/聚乙烯醇中-OH形成氢键，氧化石墨烯起着物理交联作用，造成接触角变大。亲水性增加可能是因为氧化石墨烯团聚造成氧化石墨烯与鸡蛋清/聚乙烯醇间形成的氢键减少；甚至氧化石墨烯进一步增加时，氧化石墨烯中的亲水基团被更多暴露于支架表面，从而使支架与更多的水分子结合[17]。可能因为氧化石墨烯具有sp2键合的六角形结构，是强度最大的纳米材料之一[18]，所以在力学方面，与未添加氧化石墨烯组相比，加入氧化石墨烯后显著提高了支架力学性能。氧化石墨烯含量为0.5,1g/L组杨氏模量和拉伸强度增大最明显，杨氏模量分别提高了131.9%,111%，拉伸强度分别提高了92.5%,52.6%。人骨髓间充质干细胞和人脐静脉血管内皮细胞作为骨组织工程中常见的骨再生及骨血管化的种子细胞，具有良好的骨再生和血管再生的潜力[19,20,21]。CCK-8及Live/Dead染色测定两种细胞增殖及存活率，结果显示随着支架中氧化石墨烯含量的增加，人骨髓间充质干细胞增殖率和存活率均有所递增；然而人脐静脉血管内皮细胞在氧化石墨烯含量1.5g/L支架上的增殖率和存活率均为最低，而在氧化石墨烯含量为1g/L组均为最高，这可能是因为过高的氧化石墨烯浓度具有一定细胞毒性所致[22]，可见适量氧化石墨烯的添加有助于提高细胞的增殖率及存活率。实验初步评估了该组织工程支架的诱导血管生成作用。人脐静脉血管内皮细胞的迁移和形态变化是血管结构形成的重要过程[23]。鸡蛋清具有一定的促进血管生成作用[6]。实验结果证明，适量氧化石墨烯的添加(1g/L)可进一步促进人脐静脉血管内皮细胞的迁移和细胞形态伸展，过高氧化石墨烯含量反而抑制了细胞的迁移和形态伸展,可能是过高氧化石墨烯含量会诱导细胞凋亡因子的表达水平明显升高，氧化石墨烯产生了细胞毒性[16]。

因为静电纺丝纤维类似于细胞外基质，所以静电纺丝技术越来越多地被用来构建骨组织工程支架[24,25,26,27]。骨再生既需要良好的成骨作用又需要血管化，所以制备同时具有成骨和血管生成潜能的支架是非常必要的[28,29,30]。因此实验通过静电纺丝技术首次制备了不同氧化石墨烯含量的EW/PVA/GO骨组织工程纤维支架，交联后对其进扫描电镜、亲水性、机械性能测试，评估其对人骨髓间充质干细胞和人脐静脉血管内皮细胞的细胞相容性。结果表明，氧化石墨烯的添加显著影响了支架的纤维结构、亲水性、机械性能及体外生物相容性，添加氧化石墨烯后支架的杨氏模量和拉伸强度显著增加，虽然与正常骨组织的力学性能还有所差距，但已能满足非承重骨缺损部位修复的前期力学需求。氧化石墨烯的添加使支架的亲水性有一定降低，但是依然是亲水性支架，仍然有助于细胞的增殖、扩散。鸡蛋清作为一种生物相容性较好的生物材料，具有一定的促进细胞增殖和血管生成作用[6]。氧化石墨烯对鸡蛋清/聚乙烯醇支架的改性修饰，进一步促进了材料对人骨髓间充质干细胞和人脐静脉血管内皮细胞的相容性。虽然复合支架中氧化石墨烯含量1.5g/L时人骨髓间充质干细胞的细胞增殖率及存活率均有所增加，但是该浓度下人脐静脉血管内皮细胞的细胞相容性显著降低。因此，综合亲水性、机械性能、细胞相容性来看，氧化石墨烯含量1g/L的支架不仅有良好的人骨髓间充质干细胞增殖率及存活率，以促进骨再生，而且能促进人脐静脉血管内皮细胞的增殖、存活、迁移及形态扩张，具有一定潜在促进血管生成的作用。所以，氧化石墨烯含量为1g/L的EW/PVA/GO支架是一种具有潜在成骨和促进血管生成作用的骨组织工程支架。

实验作为初步探索存在一定局限性，需要下一步的实验及探索：(1)实验已初步证明体外该支架可增加人骨髓间充质干细胞的增殖率、存活率并促进人脐静脉血管内皮细胞增殖、迁移及形态扩张。人骨髓间充质干细胞成骨分化和人脐静脉血管内皮细胞成血管过程中，复合支架优异的材料学特性将会诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化及矿化基质的分泌，以及人脐静脉血管内皮细胞间相互黏附形成血管样结构，促进骨再生及最终血管化。因此，还需进一步探索支架的体外成骨诱导性能和促进血管样结构的最终形成。(2)当前各组支架性能检测都为体外实验，下一步拟行动物体内骨修复实验，进一步证明目前实验结果的可靠性。(3)实验通过改变氧化石墨烯含量初步探索了EW/PVA/GO复合纤维作为骨组织工程支架的可行性，具有一定促进血管生成作用的鸡蛋清作为该复合支架的重要组成材料，还需进一步探索鸡蛋清含量对该骨组织工程支架的影响。此外，下一步还将添加纯聚乙烯醇作为实验的一个对照组，以进一步证实适量氧化石墨烯、鸡蛋清的添加使得该复合纤维具有更优促进骨再生的作用。

图1|不同氧化石墨烯含量的蛋清/聚乙烯醇/氧化石墨烯复合支架的宏观、微观结构及其基本特性

图2|不同氧化石墨烯含量的蛋清/聚乙烯醇/氧化石墨烯(EW/PVA/GO)复合支架的亲水性测试

图3|不同氧化石墨烯含量的蛋清/聚乙烯醇/氧化石墨烯(EW/PVA/GO)复合支架的拉伸应力测试

图4|不同氧化石墨烯含量的蛋清/聚乙烯醇/氧化石墨烯(EW/PVA/GO)复合支架的细胞增殖

图5|两种细胞分别与不同氧化石墨烯含量的蛋清/聚乙烯醇/氧化石墨烯(EW/PVA/GO)复合支架共培养7d后的Live/Dead染色结果

图6|不同氧化石墨烯含量的蛋清/聚乙烯醇/氧化石墨烯(EW/PVA/GO)复合支架中人脐静脉血管内皮细胞的迁移和形态测定

参考文献：

[26]孙宇,邹强,李轩泽,等.基于静电纺丝技术的血液生物膜的构建初探及生物相容性评价[J].中国组织工程研究,2019,23(6):901-905.

王伟宇,刘鋆,杨勇,卢涛,刘印,朱坤智,舒莉萍,叶川.静电纺丝蛋清/聚乙烯醇/氧化石墨烯复合纤维支架的制备及体外生物相容性[J].中国组织工程研究,2021,25(28):4497-4503.

基金:国家自然科学基金(81960416),项目负责人:叶川;贵州省科技厅资助项目(黔科合平台人才[2020]6013,黔科合支撑项目[2020]4Y137,黔科合[2010]3166),项目负责人:叶川;贵阳市科技计划项目(筑科合同[2019]9-1-3),项目负责人:叶川