绝经后骨质疏松症(Postmenopausal Osteoporosis, PMOP)是一种常发于绝经后5～10年的骨代谢性疾病，随着全球人口老龄化，发病人数逐年上升[1,2]。针对绝经后骨质疏松症，临床常用雌激素类及抑制骨吸收、促进骨形成药物治疗，但副作用较多[3]。中医学认为围绝经期女性肾脏虚损，肾精渐衰，故出现腰膝酸软、胸背疼痛等症候，应以补肾方药防治[4]。龟甲胶具有补肾填精、益肾健骨之效，常用于绝经后骨质疏松症的临床治疗[5]。本研究通过复制绝经后骨质疏松症大鼠模型，观察龟甲胶对骨代谢水平及AMPK/SIRT1信号通路的影响，现报告如下。

1、材料和方法

1.1 实验动物

健康雌性SD大鼠60只，SPF级，未曾交配，体重为250～350 g, 分笼于SPF级动物房饲养，保持室温为18～25 ℃,相对湿度为50%～70%,室内12 h/12 h光暗交替，动物自由进食饮水。

1.2 实验药物

尼尔雌醇片购自北京四环制药公司，规格为2 mg/片。龟甲胶购于湖南省中医药研究院附属医院，加三蒸水，大火煮沸后文火慢煮20 min, 温火蒸馏至100 mL,获得浓度为1 g/mL的龟甲胶水煎液，储存于4 ℃冰箱备用。

1.3 仪器与试剂

MEDIX90数字化双能X线骨密度仪(法国MEDILINK),显微CT影像系统(德国Siemens AG),-80 ℃超低温冰箱(美国Thereto公司),Mirofuge 20 R低温高速离心机 (美国Thermo公司),Multiskan Mk3酶标仪(美国Thereto公司),Bio-Rad电泳仪(上海一恒科技有限公司),QuantStudio 7 定量PCR仪(美国ABI公司)。大鼠血清骨钙素(BGP)、骨碱性磷酸酶(BALP)、TRACP-5b、CTX-Ⅰ ELISA检测试剂盒购自上海酶科生物科技有限公司；腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)、p-AMPK、SIRT1、PGC1-α鼠单克隆抗体，兔β-actin多克隆抗体购自美国Abcam公司；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司。

1.4 模型制备及干预

60只大鼠适应性饲养7 d后按体重高低随机分为假手术组、模型组、阳性对照组、龟甲胶低剂量组、龟甲胶中剂量组、龟甲胶高剂量组，每组各10只。除假手术组外，其余大鼠采用双侧卵巢摘除法复制绝经后骨质疏松症模型[6]:术前大鼠禁食不禁水12 h, 腹腔注射2%戊巴比妥钠充分麻醉后仰卧固定于手术台，腹部用75%乙醇消毒，去腹毛，于下腹正中作一2 cm竖状切口，去除卵巢周围的脂肪团，止血钳结扎输卵管峡部，切除双侧卵巢后止血缝合，75%乙醇消毒，术后给予青霉素(20万单位/只)肌肉注射以防感染，1次/d, 持续3 d; 假手术组大鼠仅去除卵巢周围少量脂肪，不切除卵巢。手术后5 d对各组大鼠进行阴道涂片镜检，以连续5 d无动情周期变化为模型成功标准，假手术组于观察第7天出现正常动情周期。造模完成后，阳性对照组给予尼尔雌醇片混悬液灌胃(1 mg/kg),1次/d, 持续8周；龟甲胶低、中、高剂量组按人体和大鼠体表面积比进行剂量换算，得出大鼠等效给药剂量分别为0.45,0.90,1.80 g/kg灌胃，1次/d, 持续8周。

1.5 方法

1.5.1 子宫指数测定

实验结束后处死大鼠，剥离子宫，称取子宫湿重，按公式计算子宫指数：子宫指数=子宫质量(g)/动物体重(kg)。

1.5.2 骨密度测量

实验结束后大鼠给予2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧于双能X线骨密度仪，测定大鼠L4/5及双侧股骨骨密度(BMD)。

1.5.3 骨形态参数检测

大鼠给予2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，分离右侧完整股骨，剥离干净，用浸有生理盐水的纱布包裹后置于样本管中，固定在显微CT工作槽中进行扫描，定量分析股骨远端骨微结构，分析骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁间隔(Tb.Sp)的变化。

1.5.4 血清骨代谢指标检测

大鼠给予2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，以3 000 r/min离心取上清，采用ELISA试剂盒检测血清中血清骨钙素、骨碱性磷酸酶、TRACP-5b、CTX-Ⅰ的含量：加一定量稀释的血清样品及酶标抗体于反应孔中，同时做空白孔和标准孔，酶标板置于37 ℃下反应1 h后洗涤，加入显色剂显色，37 ℃下避光15 min, 调节酶标仪波长为450 nm, 测定各孔光密度值，以标准品浓度为横坐标，相应光密度值为纵坐标作标准曲线，将血清样品光密度值代入后得出血清骨钙素、骨碱性磷酸酶、TRACP-5b、CTX-Ⅰ的浓度。

1.5.5 骨组织AMPK/SIRT1通路相关蛋白检测

大鼠给予2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后取左侧股骨，剥离干净，取部分骨组织加入RIPA裂解液，12 000 r/min, 4 ℃下离心30 min后提取总蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白定量，稀释蛋白浓度后进行凝胶电泳，湿转法转膜，加入5%TBST脱脂奶粉封闭2 h, 加入一抗(1∶1 000比例稀释)于4 ℃下过夜，加二抗(1∶5 000比例稀释)于室温下反应1 h, 显色后拍照，以β-actin、AMPK为内参，通过与内参的灰度比分别得出p-AMPK、SIRT1、PGC1-α条带的相对表达量。

1.5.6 骨组织AMPK/SIRT1通路相关mRNA检测

大鼠给予2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后取左侧股骨，剥离干净，取部分骨组织充分研磨，采用Trizol一步法提取骨组织总RNA,紫外分光光度仪测定总RNA 浓度，取2 μg组织反转录合成为cDNA后进行PCR 扩增，AMPK上游引物为5′-TTTACCTGGTTGACAAT-CGGAGCTA-3′,下游引物为5′-AATCGACTTGACCG-AGGTCTG-3′;SIRT1上游引物为5′-TGTTTCCTGTGGGATACCTGA-3′,下游引物为5′-TGAAGAATGGTCTTGGGTCTTT-3′;PGC1-α上游引物为5′-CTCGACACAGGTCGTGTTCC-3′,下游引物为5′-GCGGTGTCTGTAGTGGCTTG-3′;β-actin上游引物为5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′,下游引物为5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′。扩增条件为：95 ℃ 2 min, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 15 s, 共40个循环，以β-actin为内参，AMPK、SIRT1、PGC1-α的mRNA相对表达量以2-ΔΔCt法分析。

1.6 统计学方法

用SPSS 20.0软件分析实验数据，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，柱状图以GraphPad Prism 5.0软件绘制，结果以形式表示，P<0.05差异有统计学意义。

2、结果

2.1 龟甲胶对大鼠子宫指数的影响

与假手术组比较，模型组大鼠子宫指数明显降低，差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较，龟甲胶低、中、高剂量组灌胃干预后大鼠子宫指数均有不同程度回升，差异有统计学意义(P<0.05),随着给药剂量的提高子宫指数逐渐升高，见表1。

表1 各组大鼠子宫指数比较

2.2 龟甲胶对大鼠骨密度的影响

与假手术组比较，模型组大鼠L4/5及双侧股骨骨密度明显降低，差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较，龟甲胶低、中、高剂量组灌胃干预后大鼠L4/5及双侧股骨骨密度均有不同程度提升，差异有统计学意义(P<0.05),随着给药剂量的提高骨密度水平逐渐提高，见表2。

2.3 龟甲胶对大鼠骨形态参数的影响

与假手术组比较，模型组BV/TV、Tb.N、Tb.Th明显降低，Tb.Sp明显升高，差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较，龟甲胶低、中、高剂量组灌胃干预后大鼠BV/TV、Tb.N、Tb.Th明显提升，Tb.Sp明显降低，差异有统计学意义(P<0.05),随着给药剂量的提高各参数水平逐渐改善，见表3。

表2 各组大鼠骨密度水平比较

表3 各组大鼠骨形态参数比较

2.4 龟甲胶对大鼠血清骨代谢标志物的影响

与假手术组比较，模型组血清中血清骨钙素、骨碱性磷酸酶、TRACP-5b、CTX-Ⅰ的水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较，龟甲胶低、中、高剂量组灌胃干预后大鼠血清中血清骨钙素、骨碱性磷酸酶、TRACP-5b、CTX-Ⅰ的水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05),随着给药剂量的提高骨代谢指标水平逐渐下降，差异有统计学意义(P<0.05),见表4。

2.5 龟甲胶对大鼠骨组织AMPK/SIRT1通路蛋白的影响

表4 各组大鼠血清骨代谢标志物水平比较

与假手术组比较，模型组骨组织中p-AMPK、SIRT1、PGC1-α的蛋白表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较，龟甲胶低、中、高剂量组灌胃干预后大鼠骨组织中p-AMPK、SIRT1、PGC1-α的蛋白表达明显增多，随着给药剂量的升高p-AMPK、SIRT1、PGC1-α的蛋白水平逐渐提升，差异有统计学意义(P<0.05),见图1。

图1 各组大鼠骨组织AMPK/SIRT1通路蛋白表达  

2.6 龟甲胶对大鼠骨组织AMPK/SIRT1通路mRNA的影响

与假手术组比较，模型组骨组织中AMPK、SIRT1、PGC1-α的mRNA表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较，龟甲胶低、中、高剂量组灌胃干预后大鼠骨组织中AMPK、SIRT1、PGC1-α的mRNA表达明显增多，随着给药剂量的升高AMPK、SIRT1、PGC1-α的mRNA水平逐渐提升，差异有统计学意义(P<0.05),见图2。

图2 各组大鼠骨组织AMPK/SIRT1通路mRNA表达   

3、讨论

中医学根据绝经后骨质疏松症状表现将其归属于“骨痿”“骨枯”“骨痹”等范畴，认为肾精亏耗、肾主骨功能的低下为其内在病因[7]。现代研究亦证明[8],肾虚可致下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴失衡，与绝经后雌激素水平降低而引起的绝经后骨质疏松症病因及临床症状相同。龟甲胶具有滋阴潜阳、补肾填精、益肾健骨之效，《神农本草经》将其列为上品。现代药理证明[9],龟甲胶有效成分主要为胶原蛋白、肽类、氨基酸及各种微量元素，具有增强免疫、抗衰老、调节能量代谢等多种药理活性。林嘉辉等[10]发现，龟甲胶可通过下调 JNK、p38 MAPK的基因水平防止豚鼠软骨细胞基质降解，抑制细胞的过度凋亡，从而延缓骨关节炎进展。陈炳艺等[11]研究表明，龟甲胶能够提升关节豚骨软骨细胞MKK的基因水平，促进软骨细胞的增殖。在去卵巢骨关节炎大鼠模型中，龟甲胶可通过提升血清雌二醇(E2)水平促进膝关节软骨基质中Collagen-Ⅱ的表达量[12]。

本实验采用双侧卵巢摘除法复制绝经后骨质疏松症大鼠模型，大鼠摘除卵巢后子宫萎缩变小，子宫指数明显降低，给予不同剂量龟甲胶连续灌胃治疗后子宫指数明显回升，提示龟甲胶可抑制去卵巢所致的雌激素水平骤降，缓解子宫萎缩。骨密度可作为绝经后骨质疏松症诊断的定量指标，双能X线吸收法是目前国际公认的骨密度检测方法，其测定值为骨质疏松的诊断金标准[13]。此外，骨密度并不能完全反映骨强度变化，骨小梁微结构是影响骨强度及其功能的最重要因素[14]。本研究发现绝经后骨质疏松症大鼠骨密度明显降低，骨小梁形态学参数BV/TV、Tb.N、Tb.Th明显降低，Tb.Sp明显升高；龟甲胶灌胃治疗后，骨密度明显升高，BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高，Tb.Sp降低，提示龟甲胶可改善绝经后骨质疏松症大鼠骨微结构。血清中血清骨钙素、骨碱性磷酸酶、TRACP-5b、CTX-Ⅰ水平的变化能特异性反映骨质疏松骨代谢情况，血清骨钙素、骨碱性磷酸酶可反映成骨细胞数量及功能，TRACP-5b、CTX-Ⅰ可反映破骨细胞数量及功能[15,16]。ELISA 结果显示，绝经后骨质疏松症大鼠血清中血清骨钙素、骨碱性磷酸酶、TRACP-5b、CTX-Ⅰ水平均增高，提示卵巢摘除后成骨细胞和破骨细胞活性均有增加，导致骨转换加快，骨量流失。经龟甲胶干预后，大鼠血清中血清骨钙素、骨碱性磷酸酶、TRACP-5b、CTX-Ⅰ水平均明显降低，表明龟甲胶可影响成骨、破骨细胞活性而改善绝经后骨质疏松症大鼠骨代谢。

磷酸腺苷激活的蛋白激酶是维持细胞能量水平的重要分子，能够调节骨代谢并通过激活SIRT1等众多下游分子促进成骨细胞功能[17]。过氧化物酶增殖活化受体γ辅助活化因子1α(PGC1-α)是一种细胞能量代谢及核受体转录的辅激活因子，AMPK激活SIRT1后，使下游的PGC1-α去乙酰化激活，进而促进线粒体生物合成，并通过激活核受体活性调节雌激素水平，在雌激素调节的骨代谢过程中发挥作用[18,19]。本研究结果显示，绝经后骨质疏松症大鼠骨组织中p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC1-α的蛋白水平及AMPK、SIRT1、PGC1-α的mRNA水平明显降低，龟甲胶治疗可提高p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC1-α的蛋白及AMPK、SIRT1、PGC1-α的mRNA水平，提示龟甲胶可能通过激活AMPK和SIRT1,上调PGC1-α表达促进骨骼肌能量代谢。

综上所述，本研究表明龟甲胶对去卵巢所诱导的绝经后骨质疏松症大鼠具有明显的改善效果，能够缓解大鼠子宫萎缩程度，改善骨代谢情况和骨微结构，其作用机制可能与激活AMPK/SIRT1通路、促进骨骼肌能量代谢、提高骨密度相关。

参考文献:

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[12]杜江,黄远鹏,李奕修,等.龟鹿二仙胶及其拆方对去势骨关节炎大鼠血清雌二醇浓度及膝关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响[J].中医正骨,2013,25(3):11-20.

基金资助:湖南省中医药管理局株洲市联合中医药科研课题(E2023016);

文章来源:万文渊,罗娟,彭真灵,等.龟甲胶对绝经后骨质疏松大鼠骨代谢的影响及机制研究[J].中国中医骨伤科杂志,2024,32(04):18-23.