1、前言

有机酸（甲酸、乙酸、丙酸）具有刺激性和腐蚀性的特点，是重要的精细化工中间体，广泛应用于农药、医药、皮革等工业生产。部分有机酸（如甲酸）具有挥发性，在化工生产过程中可能释放到大气中,有机酸蒸气与空气混合后，在一定浓度范围内可能形成爆炸性混合物，如遇明火或高热可引起燃烧爆炸。有机酸产生的废水可能含有有机酸，如果未经处理直接排放到水体中，在水体中累积后可能导致水体酸化，进而对水生生物产生毒性作用，影响生物多样性。有机酸如发生泄漏或溢出，进入土壤环境,在土壤中长期积累可能对土壤微生物群落产生负面影响，同时影响土壤肥力和植物生长，进而影响土壤生态系统的稳定性和功能。在化工生产过程中，有机酸会在大气、水体和土壤中残留，《美国EPA通用土壤筛选值》居住用地土壤中甲酸的限值为1.2×105mg/kg。

目前，有机酸检测主要有液相色谱法[1-4]、离子色谱法[5-9]和高效液相色谱法等[10-11]，而关于土壤中有机酸的研究报道并不多。气相色谱法主要采用衍生化的方式，使有机酸转变为挥发性较强的酯类，随后利用不同物质在色谱柱固定相和气体流动相之间的分配系数的不同，使混合物中不同的组分进行分离，根据色谱峰的保留值及峰高或峰面积，对混合物中各组分进行定性和定量分析，由于检测前处理较为复杂，衍生化过程的回收率受限，导致整个检测过程较复杂且回收率偏低。离子色谱法主要采用直接进样的方式对清洁水样进行检测，检测结果灵敏度高、回收率好，但离子色谱的色谱柱的抗污染能力低，样品中的有机物和重金属离子浓度较高时极易破坏色谱柱，同时离子色谱柱的成本较高，因此离子色谱在土壤有机酸检测应用上存在较大的现实难度。本研究采用高效液相法，希望建立一种简便、环保、准确度高且成本低廉的土壤有机酸检测方法，为土壤有机酸检测提供新的可行途径。

2、实验部分

2.1 仪器与试剂

液相色谱仪：紫外检测器；十八烷基硅烷键合硅胶柱（C18），填料粒径为5.0μm，柱长为250 mm，内径为4.6 mm(UltiMate 3000，赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；立式双层智能精密型摇床（BSD-YX2200，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；单槽式超声清洗机（DS-240K,深圳市东森清洗设备有限公司）；温控翻转式振荡器（GGC-W*8，北京国环高科自动化技术研究院）；电子天平（ME204E，梅特勒-托利多）；甲酸（纯度>99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙酸（纯度>99.8%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；丙酸（纯度>99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙腈（液相色谱纯，上海星可高纯溶剂有限公司）；磷酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；50%氢氧化钠溶液（Extra Pure，赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；石英砂（分析纯，永华化学股份有限公司）；土壤酸碱度参比标准物质GpH-8和GpH-11（中国地质科学院地球物理地球化学勘查研究所）。

磷酸溶液（0.04%）：取0.4 mL优级纯磷酸少量纯水溶解后转移至1 L容量瓶中，用纯水稀释定容至刻线。

0.01 mol/L氢氧化钠水溶液：取50%氢氧化钠溶液0.52 mL少量纯水溶解后转移至1 L容量瓶中，用纯水稀释定容至刻线。

2.2 标准溶液配置

10 000 mg/L甲酸、乙酸和丙酸混合标准贮备液：准确移取0.820 mL甲酸、0.950 mL乙酸和1.010 mL丙酸高纯试剂，少量纯水溶解后转移至100 mL容量瓶中，用纯水稀释定容至刻线。

移取10.00 mL质量浓度为10 000 mg/L的甲酸、乙酸和丙酸混合标准贮备液纯水定容至100mL，得到1 000 mg/L的有机酸标准中间液。分别准确移取0.00、2.00、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00mL有机酸标准中间液纯水定容至100 mL，得到质量浓度为0.00、20、50、100、150、200、250 mg/L的标准浓度系列。

2.3 土壤样品的前处理条件实验设计

选取了3种不同类型的土壤样品A(pH5）（砖红色，pH=4.78，来源：江西省新余市高新区工业企业土壤）、土壤样品B(pH7）（灰色，pH=6.90，来源：浙江省建德市乾潭镇农业用地土壤）、土壤样品C(pH9）（灰色，pH=8.85，来源：浙江省嘉兴市广陈镇农业用地土壤）和石英砂，各称取10 g样品（根据干物质的量进行折算）加入5.0 mg甲酸、乙酸和丙酸标液，考察并优化确定了提取方法、提取时长、提取温度和提取液固比，具体实验方案设计见表1。

表1 前处理条件实验方案设计

2.4 液相色谱分析条件

流动相配比：5%乙腈+95%磷酸溶液（0.04%），等度淋洗15 min。

紫外检测波长：205 nm。

流动相流速：1.0 mL/min。

柱温箱温度：40℃。

进样量：10μL。

2.5 结果计算

以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，土壤中有机酸的质量比（mg/kg）可以表示为

式中：ω为土壤中有机酸的质量比，mg/kg;A为试样中有机酸的峰面积；a为标准曲线的截距；b为标准曲线的斜率；m为称取土壤样品的质量，g;wdm为土壤样品的干物质含量，%；V为浸提液的体积，mL。

3、结果与讨论

3.1 标准曲线绘制

甲酸、乙酸和丙酸混合标准溶液通过液相色谱进行检测所得标准色谱图如图1所示。结果表明，根据1.4节中液相色谱条件进行检测，甲酸、乙酸和丙酸分离度较好。根据1.2节中配置的浓度点，采用液相色谱进行检测后，以有机酸浓度为横坐标，有机酸在液相色谱图中峰面积的响应值作为纵坐标，进行曲线绘制，所得甲酸、乙酸和丙酸标准曲线的线性相关系数分别为0.999 3、0.999 7、0.999 9，均大于0.999，线性关系良好。

图1 有机酸标准溶液液相色谱图

3.2 土壤样品前处理方法优化

3.2.1 提取方式的选择

加标后样品采用水平振荡、超声提取和翻转振荡3种提取方式进行提取测定，所得加标回收率结果见表2。

表2 不同土壤样品采用不同提取方式的加标回收率结果

结果表明，水平振荡、超声提取和翻转振荡的回收率分别在87.6%～104.0%、82.2%～101.0%和72.0%～97.7%,3种提取方式中水平振荡的提取效率较超声提取略高，较翻转振荡明显好，且针对不同类型样品的加标回收率均比较稳定。此外，水平振荡温度控制效果好，可同时进行批量样品处理，因此确定提取方式为水平振荡。

3.2.2 提取时长的确定

加标后样品采用水平振荡，分别进行30 min、1 h、6 h、12 h、18 h、24 h的提取。结果表明，提取时长由30 min逐步延长至24 h，甲酸、乙酸和丙酸的回收率分别在87.1%～103.0%、90.0%～103.0%和91.5%～104.0%，提取效率随提取时间的延长基本保持不变。综合考虑提取效率和实验过程所需时间，因此确定提取时长为30 min。

3.2.3 提取温度的控制

加标后样品在15、25、35、50、70℃条件下，采用水平振荡分别进行提取。结果表明，当提取温度从15℃提高到70℃时，甲酸、乙酸和丙酸的回收率分别在92.1%～105.0%、92.3%～106.0%和90.3%～103.0%，有机酸的提取效率随提取温度的提高基本保持不变。综合考虑提取效率和低碳节能环保后，确定提取温度为室温。

3.2.4 提取液固比的确定

加标后样品分别按照液固比2∶1、5∶1、10∶1和20∶1进行提取。结果表明，提取液固比为2∶1时，提取效率明显偏低，这可能是由于液体体积较小，加入到固体样品中后与样品形成浓稠的混悬液，水平振荡时很难与振荡器产生同步振荡。提取液固比提高至5∶1后，有机酸的提取效率明显提高，达90%以上，当提取液固比从5∶1逐步提升至20∶1后，有机酸的提取效率基本保持稳定。当液相色谱法检测提取液中的有机酸的检出限确定时，固态土壤样品中有机酸的检出限随提取液固比的增大而增大，综合考虑提取效率并尽可能降低检出限，因此确定提取液固比为5∶1。

通过以上实验，土壤中有机酸提取条件确定如下：在250 mL棕色玻璃丝口瓶中，称取土壤样品干基重量10 g（经干物质的量折算后），按照提取液固比5∶1加入50 mL纯水，加盖后室温条件下水平振荡提取30 min，自然沉降约30 min，取上清液用0.45μm水系微孔滤膜过滤后，液相色谱法测定。

3.3 样品保存时间的确定

每隔一段时间取4℃以下冷藏保存的加标后样品A、B、C和石英砂各3份进行提取，所得加标回收率结果如图2所示。

结果表明，样品于4℃以下冷藏保存时，当保存时间不超过6 d时，有机酸的加标回收率比较稳定，均在85%以上；当保存时间超过6 d后，有机酸的加标回收率逐渐下降，其中碱性土壤中有机酸的回收率下降趋势最为明显，石英砂中有机酸的回收率最为稳定。

图2 不同土壤样品在4℃冷藏保存，有机酸加标回收率随保存时间的变化

土壤样品A、B、C和石英砂加标样品的提取液密封后，于4℃以下冷藏保存，每隔一段时间进行重复测定，提取液的质量浓度变化如图3所示。

结果表明，不同提取液在4℃以下冷藏保存，当保存时间不超过23 d时，有机酸的质量浓度随保存时间的延长基本保持不变。因此，土壤样品采集后，可在4℃以下冷藏保存6 d，若样品无法在6 d内完成分析的，应在6 d内完成提取，提取液在4℃以下冷藏保存，保存时间不超过23 d时，检测的质量浓度结果不会有明显变化。

3.4 方法验证

3.4.1 检出限试验

采用优化确认后提取条件，根据HJ 168—2020《环境监测分析方法标准制订技术导则》的要求，对样品A进行7组平行加标，得到有机酸检测结果的不确定度，方法检出限为3.143倍的标准偏差，结果见表3。

图3 不同土壤样品的提取液在4℃以下冷藏保存，有机酸加标回收率随保存时间的变化

3.4.2 准确度和精密度试验

采用优化确认后提取条件，分别对土壤样品A（江西新余，砖红色、pH=4.78、粉砂土）、标准物质GpH-8（河北丰润，褐色、pH=7.51、褐土）、标准物质GpH-11（吉林镇赉，褐色、pH=9.22、黑钙土）和石英砂样品进行空白试验（双平行）和加标试验（六平行），结果见表4。采用液相色谱法对不同类型的土壤中有机酸进行低浓度、中浓度和高浓度加标后，甲酸、乙酸和丙酸的样品加标回收率分别为97.9%～106.0%、99.7%～105.0%和97.3%～103.0%，六平行结果的相对偏差为1.2%～7.0%。结果表明，该方法准确度高、精密度好。

表3 有机酸方法检出限测定结果

表4 不同类型土壤的有机酸加标回收率结果

3.5 实际地块土壤中有机酸测定结果及分析

方法建立完成后，选取了一个实际造纸厂地块，根据用地历史情况，在该造纸厂地块的造纸车间、碎浆间、污水池、生化池、废纸仓库、锅炉房等可能存在污染的区域设置了7个土壤采样点，同时在地块外南侧、北侧分别设置了2个土壤点作为对照点。采用Geopreobe直推式土壤样品取样钻机，为了避免有机酸挥发等造成检测结果偏差，本单位通过直接钻取的方式获得土壤样品，采样深度设置为6 m。各采样点位钻取的土样经过现场筛查后，选择4个不同深度的土层带回实验室进行样品检测，地块外采样深度与地块内土壤采样深度相同。该地块土壤样品有机酸的检测结果显示，地块中点位和对照组样品有机酸检测结果均为未检出

4、结语

实验采用3种不同类型的土壤样品A(pH5）（砖红色，pH=4.78，来源：江西省新余市高新区工业企业土壤）、土壤样品B(pH7）（灰色，pH=6.90，来源：浙江省建德市乾潭镇农业用地土壤）、土壤样品C(pH9）（灰色，pH=8.85，来源：浙江省嘉兴市广陈镇农业用地土壤）和石英砂，考察并优化确定了提取方法、提取时长、提取温度和提取液固比，建立了高效液相色谱仪测定土壤中有机酸的检测方法。

实验结果显示，土壤中的有机酸检测样品在4℃以下冷藏条件下可稳定保存长达6 d，而提取液则能在相同条件下至少保存23 d。在样品处理过程中，按照提取液固比5∶1的比例加入纯水，加盖后在室温条件下水平振荡提取30 min，随后自然沉降约30 min。待上清液过滤后，采用液相色谱法准确测定土壤中的有机酸含量。当样品称取量为10.0 g时，土壤中甲酸、乙酸、丙酸的方法检出限分别为23、30、36 mg/kg，表明该方法具有高度的灵敏性。同时，有机酸的加标回收率介于97.3%～106%之间，显示出优异的准确性。检测结果的相对偏差范围在1.2%～7.0%之间，充分证明了该方法的可靠性，能够完全满足土壤检测的要求。该方法在前处理过程中摒弃了复杂的衍生化步骤，极大地简化了操作流程。更值得一提的是，整个提取过程中仅使用了纯水作为溶剂，未涉及任何有机溶剂等试剂，从而显著提升了环保性。此外，经过验证，该方法不仅准确度高，而且样品通量大，试剂消耗少，极大地提高了分析效率，降低了单个样品的分析成本。这些优势使得该方法在土壤有机酸检测领域具有极强的实际应用性。

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