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黄连提取液对多重耐药鲍曼不动杆菌抑菌作用及对其生物膜影响

2024-09-03 169 上传者：管理员

摘要：目的探讨黄连提取液对多重耐药鲍曼不动杆菌(MDR-Ab)抑菌作用及对其细胞膜的影响，为黄连提取液治疗MDR-Ab提供理论依据。方法 2023年5月采用牛津杯法测定黄连提取液对MDR-Ab的最低抑菌浓度(MIC),扫描电镜观察黄连提取液对MDR-Ab菌体结构的破坏，碘化丙啶染色法观察黄连提取液对MDR-Ab生物膜的作用，检测黄连提取液对MDR-Ab作用后细胞内外三磷酸腺苷(ATP)含量。结果黄连提取液对MDR-Ab的MIC为64 mg/mL。黄连提取液处理的MDR-Ab菌体形态发生凹陷、扭曲等改变，大部分染成红色，且其形态改变程度、染成红色比例均与黄连提取液浓度呈正比。MDR-Ab细胞内ATP含量随黄连提取液浓度增高逐渐减少，细胞外ATP含量随黄连提取液浓度增高逐渐增多。结论黄连提取液对MDR-Ab具有抑菌作用，且通过破坏MDR-Ab细胞膜发挥抑菌作用。

关键词：
多重耐药鲍曼不动杆菌
生物膜
耐药病原体
获得性感染
黄连
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鲍曼不动杆菌(Ab)是医院内6种(粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、Ab、铜绿假单胞菌和肠杆菌等)主要的具有严重耐药病原体ESKAPE之一，可引起多种医院获得性感染和严重的治疗并发症，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2相关肺炎[1]。Ab还会引起社区获得性感染，死亡率高达64%[2]。Ab具有较强的生命力，可在干燥的环境中存活较长时间。其具有较强的附着力，容易黏附在物体表面，形成生物膜抵抗抗菌药物，从而产生耐药性[3-4]。临床存在多重耐药Ab(MDR-Ab)和完全耐药Ab。MARAKI等[5]研究表明，临床分离的Ab中92.89%存在3种或3种以上的抗菌药物耐药，MDR-Ab诱导或加重了医院内患者，尤其是重症监护病房的重症患者的感染，使病情进一步恶化，给临床治疗及预防工作带来的影响越来越引起广泛重视[6]。为防止临床致病菌的耐药性加重、给临床工作提供更加有效的治疗方案，如何预防和控制MDR-Ab的感染已是全球医院需解决的难题，2017年Ab已在世界卫生组织优先开发新药的病原体清单中占据首位。

中药具有独特的优势，如作用靶点多、药理活性强、不良反应少、具有突出的抗耐药性等作用。黄连为毛茛科植物黄连(Coptis chinensis Franch.)、三角叶黄连或云南黄连的干燥根茎。始载于《神农本草经》,为我国常用中药之一，能泻火、解毒、清热、燥湿等。现代药理研究表明，黄连具有抗菌、抗内毒素、抗病毒、增强免疫、解热、抗溃疡、降血糖、解毒等作用[7-8]。黄连对MDR-Ab的作用少见相关文献报道。本研究探讨了黄连提取物新的药理作用，进一步开发成新药，为其用于治疗临床Ab感染性疾病提供理论依据，现报道如下。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1中药

黄连购于广西壮族自治区百色市大参林药店，经右江民族医学院药学院梁威教授鉴定为黄连。

1.1.2实验菌株

MDR-Ab 8D2临床分离菌株经梅里埃细菌鉴定药敏仪鉴定为Ab,主要耐哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉维酸、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、庆大霉素等抗菌药物。

1.1.3主要试剂和仪器

碘化丙啶(PI)染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司)、SOO27三磷酸腺苷(ATP)检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)、D3024R高速冷冻型微量离心机(南北仪器有限公司)、Synergy H1多功能酶标仪(上海新领生物科技发展有限公司)、SBC-12小型离子溅射仪(北京中科科仪股份有限公司)、KYKY-EM8100扫描电子显微镜(北京中科科仪股份有限公司)、PA53FS6正置荧光显微镜(厦门麦克奥迪实业集团有限公司)等。

1.2方法

1.2.1提取黄连提取液

2023年5月采用煎煮法提取黄连提取液[9]。将90 g黄连加入900 mL蒸馏水(1∶10)加热煮沸后文火煎煮，提取时间大概1 h。纱布过滤，收集滤液，药渣继续加900 mL蒸馏水煎煮，步骤与上一步骤相同。合并2次滤液蒸发浓缩体积为25 mL左右，等待冷却后用保鲜膜封口，冰箱冷冻，再进行真空冷冻干燥。

1.2.2测定黄连提取液最低抑菌浓度(MIC)

肉汤培养基(LB)培养液稀释光密度(OD)600到0.3,此时菌液浓度为1×108CFU/mL,取无菌1.5微量离心管(EP)管5支，用二倍稀释法将黄连提取液在1.5 EP管中以无菌水稀释为512、256、128、64、32 mg/mL备用，编号1～5。取5个空白培养基，编号1～5。采用牛津杯法向编号1～5的空白培养皿中加入2%素琼脂，冷却后将牛津杯放置在素琼脂上轻轻按压至不留间隙，将100μL配制好的菌液与0.7% LB琼脂混匀后倒在素琼脂上，凝固后轻轻旋转拿出牛津杯，分别加入配制好的药液100μL,置37℃培养箱中培养24 h后观察有无抑菌圈，测量抑菌圈直径，平行实验3次。

1.2.3测定黄连提取液对MDR-Ab生长曲线的影响

将1.5×108CFU/mL菌液100μL接种于无菌96孔板第一排的1～6孔中，将256、128、64、32、16 mg/mL黄连提取液各100μL加入1～5孔中，第6孔空白对照组加入LB培养液100μL,第7孔加入LB培养液200μL,每组3个复孔。用多功能酶标仪A570 nm处每2小时测量A值，以培养时间为横坐标，测出的A值为纵坐标绘制24 h生长曲线。

1.2.4扫描电子显微镜观察黄连提取液对MDR-Ab 8D2的破坏作用

取1.5 EP管12支分为空白对照组和黄连组(包括1/4MIC组、1/2MIC组和MIC组),每组3支。黄连组配制浓度为1×108CFU/mL的菌液750μL分别与1/4MIC、1/2MIC、MIC黄连提取液750μL混合。空白对照组加入750μL的菌液和LB培养液750μL。所有样品均在恒温培养箱中37℃培养4 h。取出后以12 000 r/ min离心5 min取上清液，加入戊二醛溶液在4℃冰箱固定过夜。第2天取出后离心，依次加入30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液各1次，每次30 min。放入烘干箱烘干，真空条件下镀金处理，用扫描电子显微镜观察每组样品，随机挑选若干视野拍照。

1.2.5荧光显微镜观察黄连提取液对MDR-Ab的破坏作用

配制浓度为1.5×108CFU/mL的菌液。取2个50 mL离心管，编号1～2。编号1的离心管加入菌液和64 mg/mL的黄连提取液各3 mL,编号2的离心管加入菌液3 mL和空白LB培养液。恒温培养箱中37℃培养4 h取出后以12 000 r/min离心1 min,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，最后一次离心后弃上清液，分别加入PI试剂20μL。37℃培养30 min,取出后以12 000 r/min离心1 min,用PBS洗涤2次，弃上清液，分别加入PBS使其沉淀悬浮起来，取5μL制片。在正置荧光显微镜下观察细菌的染色情况，视野下PI染色死细胞呈红色。

1.2.6测定MDR-Ab 8D2细胞内外ATP含量

取6支1.5 EP管，编号1～6。菌株划线纯化后挑取单个菌落至5 mL LB培养基中，摇菌16 h。第二天以1∶10比例转到50 mL新鲜培养基中，继续摇菌4 h。5 000 r/min离心10 min,用PBS(pH=7.4)洗涤和重悬细胞3次，调配制OD600=0.5,吸取调制好的菌液500μL分别加入EP管中，加入1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC、4MIC的黄连提取液500μL到编号1～5号EP管中，6号EP管加入LB培养液500μL作为空白对照组，37℃培养箱培养1 h。菌悬液4℃,以12 000 r/min离心5 min。吸取100μL ATP检测工作液(ATP检测试剂和ATP检测试剂稀释液为1∶4),分别加入16196-3SSB96孔板(黑色)中等待3 min,再分别加入6支EP管中的上清液20μL,迅速混匀，间隔5 s后用多功能酶标仪测定细胞外ATP含量。在弃上清液的6支EP管中分别加入400μL裂解液，37℃水浴15 min,充分裂解细菌。裂解后4℃、12 000r/min离心5 min,取上清液，用于测定细胞内ATP含量。每孔加入ATP检测工作液100μL到16196-3SSB96孔板(黑色)中，室温孵育5 min,充分消耗本底ATP,加入上清液20μL迅速用移液枪混匀，间隔5 s后用酶标仪测定细胞内ATP含量。平行实验3次。

1.3统计学处理

应用WPS、GraphPadPrism8软件作图，应用SPSS20.0统计软件进行数据分析，计量资料以x¯±s表示，计数资料以率或构成比表示，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)、χ2检验等。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1黄连提取液MIC

黄连提取液MIC为64mg/mL。见表1。

表1黄连提取液MIC

2.2黄连提取液对MDR-Ab 8D2生长曲线的影响

MDR-Ab8D2生长曲线大致呈“S”型，具有对数生长期和稳定生长期。MIC、2MIC组细菌生长被明显抑制。随时间增长，MIC组细菌生长曲线无太大的浮动，说明黄连提取液对MDR-Ab8D2的生长具有明显的抑制作用。见图1。

图1黄连提取液对MDR-Ab8D2生长曲线的影响

2.3黄连提取液对MDR-Ab 8D2的破坏

空白对照组菌体形态正常饱满，细胞膜结构完整。与空白对照组比较，1/4MIC组少量菌体形态不正常饱满，菌体表面开始皱缩；1/2MIC组多数菌体表面皱缩，少许菌体细胞膜开始破损，MIC组大量细菌的细胞膜表面破裂，细菌形态严重变化。表明黄连提取液能破坏细菌形态，且随黄连提取液浓度增高细菌菌体表面开始皱缩，细胞膜破损逐渐严重，形态逐渐发生改变。见图2。空白对照组菌体PI染色少，细菌生长良好；黄连组菌体PI染色增多(占80%),且染成红色比例与黄连提取液浓度呈正比。见图3。

图2黄连提取液对MDR-Ab8D2形态的影响

图3PI染色

2.4细胞内外ATP含量变化

细胞内ATP含量随黄连提取液浓度增高逐渐减少，细胞外ATP含量随黄连提取液浓度增高逐渐增多。见图4。

图4细胞内外ATP含量变化

3、讨论

细菌生物膜是一种结构复杂、功能多样的“动态细菌组织”,可帮助细菌抵抗恶劣的外界环境，是大部分细菌的主要生活方式[10-11]。有研究发现，中药抗菌作用主要通过抑制细胞壁的合成、提高细胞膜的渗透性、抑制蛋白质、核酸的代谢、防止外膜蛋白的丢失、阻断药物的主动外排，从而抑制细菌的生长，发挥抗菌作用，黄连对Ab具有良好的抗菌活性，黄连通过改变Ab细胞膜的渗透性，破坏细胞膜完整性而发挥抗菌作用[12]。

细菌在药物干扰下会出现不同程度的形态改变，可通过扫描电子显微镜进行观察[13]。在没有被药物干扰时细菌形态完整、饱满，无缺水皱缩现象，细胞壁、细胞膜结构完好；细菌受到某些刺激时细胞形态就改变。由本研究图2可见，MDR-Ab8D2菌体形态可被黄连提取液影响，形态发生变形，且影响程度与黄连提取液浓度呈正比。

PI不能穿入完整的活细胞膜中，只能通过受损的细胞膜[14],随后与DNA结合并发出红色荧光。由本研究图3可见，黄连组菌体PI染色后红色荧光增多，提示黄连提取液通过破坏MDR-Ab8D2细胞膜使菌体大量死亡。细菌生物膜被包裹在细胞外基质中，在发病机制中起关键作用，使治疗选择更加困难[15]。Ab也有形成生物膜的能力，因此，探讨中药抗Ab生物膜意义重大。

对中药抗Ab生物膜机制的研究发现，许多中药具有抑制Ab生物膜形成和破坏生物膜的作用[16],如李晓君等[17]发现，5种中药颗粒剂可能对细菌内叶酸合成途径及细菌蛋白质形成产生影响，中药提取物可通过抑制细菌DNA合成和膜蛋白合成从而破坏生物膜。Ab生物膜的形成是一个复杂的过程，需要群体感应基因(QS)、bap、blaPER-1、csuE、ompA等生物膜相关基因的参与[18]。相关研究表明，QS达到一定浓度后可参与细菌生物膜的形成和毒力因子的表达，QS与抗菌药物不同，不会对细菌产生选择压力，进而减少抗性突变体的出现和传播。黄连可能通过抑制DNA合成、膜蛋白合成和QS破坏大肠杆菌的生物膜。

ATP是生物体细胞内的能量来源[19],在呼吸和代谢中起着核心作用，是许多酶促反应中最重要的能量提供者，ATP合成酶在MDR-Ab菌株中被高度上调[20-21]。微生物的膜电位是由钠、钾、氯、镁、氢等离子浓度梯度产生和维持，如细菌膜受损，小离子就会被滤出，因此，细胞内释放的ATP等成分的测定也可用于监测黄连提取液引起的膜损伤。微生物中ATP含量的测量可以与活力、代谢活力或利用细胞内ATP的平均浓度或量有关[22]。本研究结果显示，细胞内ATP含量与黄连提取液浓度呈反比，性别外ATP含量与黄连提取液浓度呈正比，进一步说明黄连提取液处理MDR-Ab8D2后使其细胞膜受损，细胞内ATP外漏。

综上所述，黄连提取液可有效抑制MDR-Ab8D2的生长，其抑菌机制可能与破坏菌体形态、影响细胞膜的通透性和完整性有关。

参考文献:

[6]侯良,周瑞芬,刘华之,等.鲍曼不动杆菌临床分布特点及耐药性监测分析[J].当代医学,2018,24(15):52-54.

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[9]吕益飞,谭予钒,杨贵蓉,等.黄连水提物对小鼠白色念珠菌性阴道炎的影响[J].遵义医学院学报,2016,39(3):255-259.

[12]汤嘉文,李培源.中药抗菌活性及作用机制研究[J].山东化工,2019,48(20):78-79.

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[14]万朋奇.抗菌聚氨基酸的合成及其构效关系的研究[D].长春:东北师范大学,2022.

基金资助:右江民族科学技术局医学院校级科研基金项目(yy2020ky025);大学生创新创业训练计划项目(S202110599094;S202210599107);百色市科学研究与技术开发计划项目(20203403);

文章来源:余艳妮,覃艳春,蓝怡,等.黄连提取液对多重耐药鲍曼不动杆菌的抑菌作用及对其生物膜的影响[J].现代医药卫生,2024,40(16):2708-2712+2718.