口腔颌面部的组织类型和结构极其复杂，牙髓、牙周、骨、皮肤、神经等多种组织彼此协同，发挥重要且精细的功能作用。因此，口腔颌面组织损伤后的修复再生一直是临床及基础研究中关注的重点和难点。外泌体(exosome, Exo)作为在上世纪90年代发现的新兴生物分子，开创了新型无细胞疗法。传统的干细胞移植可能造成致瘤性、免疫原性等方面问题，而外泌体的生物相容性好，易于获得，可以通过旁分泌效应影响远端组织细胞，介导细胞间通讯和药物递送，便于靶向调控组织再生，展现出巨大的治疗潜力。

1、外泌体及其特点

目前的研究表明，外泌体参与机体基本的生理过程，如神经元通讯、抗原呈递、免疫应答、器官发育和组织修复。通常外泌体是直径为30～200 nm的单膜囊泡。正常情况下，外泌体是通过内吞膜的内陷和腔内囊泡(intraluminal vesicle, ILV)而形成。在成熟过程中，内容物通过囊泡转运分类内涵体(endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)依赖性或ESCRT非依赖性途径掺入ILV中，早期内体的成熟产生多囊泡体(multivesicular bodies, MVB)。MVB可以被转运到反式高尔基体网络进行内体循环，输送到溶酶体进行降解，或沿着微管移动与质膜融合，并将外泌体释放到细胞外[1]。已有部分实验证实，miRNA进入外泌体存在由某些特定蛋白介导的主动分选机制[2],但目前还未系统性阐述，需要进一步探索。MVB与细胞膜的融合是一个微调的过程，需要几个关键因素，如Rab GTP酶和可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors, SNAREs)复合物[3]。来自源细胞的外泌体可以通过内吞作用、直接膜融合和受体-配体相互作用递送至靶细胞，完成信号传导或物质传递[4]。

但是不同来源的外泌体中含有不同的内容物，发挥不同的功能，即其异质性与所发挥的生物学功能相互关联。外泌体内容物包括RNA、蛋白质、脂质三大类，其蛋白质种类包括与细胞穿透、侵袭和融合相关的4种跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82);参与抗原结合和呈递的热休克蛋白(heat shock protein, HSP)70、HSP90;ALG2相互作用蛋白X(ALG2 interacting protein, Alix)、肿瘤易感性101基因(tumor susceptibility gene 101,TSG101)参与外泌体释放；膜联蛋白和Rab27负责膜转运与融合等。RNA是当下外泌体的研究热点，其中微小RNA(miRNA)占比最多；mRNA作为模板可以改变受体细胞的基因表达；长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA)在肿瘤的发生发展及黏附中起作用；circRNA由于稳定的闭环结构，很难降解，所以可以作为肿瘤标志物。此外，外泌体中的脂质含有鞘磷脂、磷脂酸、胆固醇，不仅起到包裹内容物的作用，也具有生物活性[5]。

给予细胞不同的预处理，如低氧、缺血、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激等，可使其释放的外泌体包含不同的“货物”。有研究表明，低氧条件下发挥作用的内容物miRNA和感知氧应激、调节氧稳态的重要分子缺氧诱导因子互相有串扰[6],但对于其它类型RNA和蛋白质、脂质等无从知晓。总之，缺氧可以改变外泌体的质量和数量。来源于肠道微生物组的革兰氏阴性菌和入侵病原体上都含有LPS。一旦裂解释放进入循环，LPS并不是以游离状态直接作用于靶细胞激活炎症小体[7],而是通过脂质A与外泌体的双层脂质直接结合，被宿主来源的外泌体捕获，然后由CD14依赖性受体介导内吞作用转移到胞质，激活非经典NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎症小体[8]。另外也有研究发现，外泌体释放速率随LPS的刺激时间先升高后降低，表现出明显的时间规律[9]。

2、外泌体与颌面组织再生

2.1外泌体与牙髓组织再生

在牙齿的发育、自我更新和修复过程中，间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)分化产生牙髓细胞和成牙本质细胞[10],形成牙髓牙本质复合体，所以干细胞的成牙分化、神经感觉恢复和血运重建对于牙髓牙本质复合体的再生有重要作用。外泌体在诱导干细胞分化、外周神经轴突生长和血管内皮细胞的迁移等发挥重要作用。

血管再生是牙髓牙本质复合体再生的基础，充足的血液供应是组织再生的必要条件。大量研究证明，干细胞的外泌体可以对内皮细胞的迁移、增殖、分化有促进作用。研究发现牙髓干细胞(dental pulp stem cell, DPSC)来源的外泌体被内皮细胞有效摄取后，激发基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)9、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)-A和激酶插入区受体(kinase insert domain receptor, KDR)表达水平，引发促血管作用[11]。另外我们研究团队发现，乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)来源的外泌体转运miR-26a,增强内皮细胞的管腔形成能力和诱导干细胞向成血管分化，进而促进再生牙髓中的血管生成[12];并且于2021年提出天然牙齿的脱细胞基质通过启动DPSC牙齿发育基因的表达，促进聚合体的形成和外泌体的释放，从而提高成牙能力和血管生成能力，以治疗年轻恒牙完全脱位造成的牙根吸收及根骨粘连等问题[13]。这些发现为保护功能性器官再生的发育微环境提供了一种先进的方法。

牙本质唾液蛋白(dentin salivary protein, DSP)、牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotein, DPP)和牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein-1,DMP-1)是主要存在于牙本质基质中的家族蛋白，在牙本质形成和矿化过程中发挥重要作用。DPSC来源的外泌体可通过激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路促进矿化，上调特异性牙源性基因的表达，从而促进牙本质再生[14]。根尖牙乳头干细胞来源的外泌体可被骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)内吞，通过上调BMSC中DSP的表达，促进矿化结节的形成，调节牙本质的形成[15]。此外，来自上皮根鞘的外泌体通过激活Wnt/β-catenin信号，可以增加碱性磷酸酶的活性，诱导矿化结节的形成[16]。同时，牙源性干细胞(DPSC、根尖牙乳头干细胞和SHED等)源自颅神经嵴细胞，其产生的外泌体在牙髓再生过程中可以诱导神经相关细胞的迁移分化。已有研究表明，用LPS预处理的DPSC分泌的外泌体可促进施万细胞(schwann cell)的增殖和迁移，说明牙髓组织损伤可促进施万细胞迁移到损伤部位，从而促进牙髓的修复和牙本质的再生[17]。

2.2外泌体与牙周组织再生

牙周组织是由牙骨质、牙周膜、牙槽骨、牙龈组成的对牙体有机械支持作用并具有复杂分层结构的组织。牙周炎是一种由微生物引起牙周组织过度免疫性破坏的疾病，已成为全球第六大疾病[18]。因此，牙周组织的结构再生和功能重建的关键在于炎症控制和牙根表面新生牙骨质-牙周膜-新生骨分层结构的再生与联接附着。外泌体由于其低免疫性和高安全性已成为牙周再生的潜在治疗策略。

牙周炎作为口腔局部炎症，与全身炎症疾病密切相关。先前研究发现糖尿病牙周炎患者中，代谢受损肝脏分泌外泌体靶向聚集在牙周区域，通过外泌体中脂肪酸合成酶诱导牙周膜细胞(periodontal ligament cell, PDLC)异位脂肪酸合成，并激活消皮素D(gasdermin D)的裂解，加速PDLC焦亡，加重牙周炎患者的不可逆性牙槽骨丢失[19]。提示需要充分了解外泌体在不同组织间的通讯交流，及其在牙周炎发生发展中所发挥的作用，从而提高牙周炎所致的全身系统性疾病的预防及治疗。

对于牙周炎导致的牙槽骨退缩和牙周组织破坏，可以通过免疫调节促进组织再生，从而保护正常组织。Elashiry等[20]从树突状细胞(dendritic cell, DC)中分离出外泌体，并将其与抗炎因子转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β1和白介素(interleukin, IL)-10一起装载，通过静脉注射途径或局部递送到覆盖牙槽骨的软组织中，被DC和T细胞原位摄取，从而抑制骨吸收，减少骨丢失。笔者研究团队发现，经外泌体处理后的DPSC通过增强线粒体氧化磷酸化，从而提高成骨分化能力，促进大鼠牙槽骨的再生[21]。此外研究证明，来自MSC的外泌体同样具有免疫调节和控制炎症的作用[22]。Watanabe等[23]研究表明，MSC衍生的外泌体降低成骨细胞、成纤维细胞的衰老数量和水平，降低炎性细胞因子的表达水平，从而减缓衰老细胞周围慢性炎症的扩散，并促进血管生成和骨再生。另外，有研究发现3D培养产生的MSC来源的外泌体(MSC-Exo)富集更多miR-1246,可以抑制辅助性T细胞(T helper cell 17,Th17)极化的关键因子——活化T细胞核内因子5(nuclear factor 5 of activated T cells, NFAT5)的表达，从而恢复牙周组织中Th17/调节性T细胞(regulation T cell, Treg)平衡，增强抗炎作用[24]。巨噬细胞M1向M2的及时转变，对于牙周炎的治疗必不可少，并且源自M2巨噬细胞的外泌体(M2-Exo)有靶向炎症部位、调节免疫微环境、抑制炎症的作用，所以应用M2-Exo也是治疗牙周炎的有效途径。构建含有褪黑素(melatonin, Mel)的工程化M2-Exo,通过减少过度的内质网应激和未折叠蛋白反应，促进PDLC在炎症状态下的成骨、牙骨质能力，从而减轻牙槽骨退缩，协同发挥M2-Exo靶向治疗炎症、促进再生和Mel骨保护作用[25]。需要注意的是，外泌体的异质性、有效时间和长期疗效不稳定，因此工程化囊泡的构建和应用将是牙周组织再生重要的研究方向之一。

此外，牙骨质再生一直被认为是牙周再生的关键。已有研究发现通过基因工程敲除酪蛋白激酶-2相互作用蛋白-1(casein kinase 2 interacting protein-1,Ckip-1)可以抑制巨噬细胞的M1极化，促进M2极化，从而促进成牙骨质细胞矿化和牙骨质形成[26]。有研究构建了源于Ckip-1敲除的巨噬细胞的外泌体，其中靶向Ckip-1基因的Let-7f-5p下调成牙骨质细胞的Ckip-1基因，激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α,PGC-1α)依赖的线粒体生物合成，从而改善由牙龈卟啉单胞菌抑制的成牙骨质细胞矿化和牙骨质生成[27]。

牙周膜是牙骨质和牙槽骨的连接位，其再生同样至关重要。Chew等[28]设计了负载MSC-Exo的胶原海绵，在牙周缺损大鼠模型中，通过激活腺苷受体介导的AKT和ERK信号通路，增强PDLC的迁移和增殖，促进牙周膜等组织再生。需要注意的是，牙周膜连接牙骨质和牙槽骨，在再生过程中既要保证三者有空间分隔，能独立再生，同时还要促进不同相之间的界面组织整合，达到有序再生的效果，最终实现牙周结构和功能的再生[29]。

3、外泌体与骨组织再生

3.1外泌体与骨再生

骨损伤后的再生修复是一个复杂且缓慢的过程，需要多种细胞的协调参与。目前临床上的治疗方法主要是自体骨移植，但是面临着感染、早期血管化不足、骨来源不足等诸多问题。近来，外泌体联合支架的修复方法越来越受到重视，可以影响成骨分化、血管重建和神经支配，促进骨再生。

MSC-Exo可调节成骨分化促进骨再生。有研究发现，颌骨骨髓来源的MSC可以有效摄取DPSC的外泌体，进而促进成骨基因的表达，如Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶和骨钙素，从而提高成骨倾向并增加下颌骨缺损处的新骨密度[30]。脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cell, ADSC)容易获取，其外泌体在骨再生方面研究也十分广泛。ADSC来源外泌体(ADSC-Exo)良好的免疫调节功能、促血管重建能力，为骨再生创造了有利的骨免疫微环境，从而刺激BMSC增殖、迁移、成骨分化，表现出良好骨再生能力[31]。外泌体还可以结合支架促进骨再生。Kang等[32]构建新型聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(lactic acid-co-glycolic acid, PLGA)/镁离子-没食子酸(Mg2+-gallic acid, Mg2+-GA)支架并将ADSC-Exo沉积附着其上缓慢释放，可稳定骨再生微环境，增强抗炎能力，保证血液供应，促进成骨分化，加速骨重建。

骨再生的基础是建立新生血管网，从而为骨再生提供营养因子，运输干细胞和无机盐离子，清除代谢废物，因此促进成骨-成血管耦合具有重要意义。有研究团队用含骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)和VEGF-A的质粒DNA转染ADSC,其产生的外泌体不仅包含内源性BMP-2和VEGF-A的mRNA,还可以增加相关miRNA的含量，起到协同促进成骨成血管高效再生的作用[33]。此外，恢复骨骼的神经支配对于骨修复也至关重要。用神经生长因子刺激MSC所得外泌体，通过其中的miRNA激活MAPK和PI3K-AKT信号通路，可以营养神经，改善神经细胞功能，从而促进神经支配骨再生[34]。

3.2外泌体与软骨再生

由于软骨缺乏血管和神经支配，所以几乎没有自我修复的能力。然而骨关节炎(osteoarthritis, OA)和颞下颌关节(temporomandibular joint, TMJ)紊乱引起的软骨损伤缺损普遍存在，在临床上常见的关节置换和软骨移植也有免疫、承重效力有限等问题。过去组织工程中常见方法是将软骨细胞或干细胞与支架相结合，但是这些“种子细胞”不能被靶向调控，并且治疗效果有限、免疫副作用大。使用外泌体结合生物活性材料进行软骨再生可以避免上述缺点。

利用海藻酸钠-多巴胺(alginate-dopamine, AD)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate, CS)和再生丝素蛋白(regenerated silk fibroin, RSF)的交联网络制备与湿表面具有高结合强度的水凝胶，AD/CS/RSF水凝胶包封外泌体后，促进BMSC迁移、增殖和分化。最重要的是，该水凝胶可与促进软骨缺损原位再生和细胞外基质重塑，其释放的外泌体通过趋化因子信号通路将骨髓基质细胞募集到水凝胶和新软骨中[35]。此外已知滑膜液来源的间充质干细胞(synovial fluid-derived mesenchymal stem cell, SF-MSC)移植是治疗OA软骨退变的一种可行方法，但是控制移植的SF-MSC在关节中的软骨分化仍然是一个挑战。Kartogenin(KGN)是一种可诱导SF-MSC向软骨细胞分化的小分子物质。然而，由于KGN水溶性差，导致有效浓度低，限制了其促软骨形成能力。所以，研究团队通过工程化外泌体将KGN包裹靶向递送至SF-MSC,促使KGN在胞质溶胶中均匀分散，增加其在细胞中的有效浓度，显著促进SF-MSC的软骨形成[36]。颌面部的主要软骨组织集中TMJ,但是目前对于外泌体治疗TMJ骨关节炎的研究较少。除了需要抑制炎症，还要恢复基质稳态和促进软骨再生。有研究团队发现，治疗TMJ骨关节炎可以通过MSC外泌体中腺苷激活AKT、ERK和AMPK信号传导，减轻炎症，增强基质合成，同时减少细胞凋亡和基质降解，以实现整体关节内稳态，促进TMJ修复和再生[37]。

4、外泌体与创伤愈合

颌面部皮肤的创伤不愈或愈合不良，会对患者造成生理和心理的双重影响。针对创伤愈合中凝血、炎症调节、增生和重构等4个过程，构建不同的外泌体，可以发挥不同的靶向调控作用，达到促进皮肤愈合的功效。炎症是伤口愈合皮肤修复的一个重要级联反应阶段，但长期炎症是有害的。同上述，当前研究也多集中于MSC-Exo调节巨噬细胞极化方向。我们团队于2019年研究发现，输注的BMSC和颌骨骨髓间充质干细胞(jaw bone marrow mesenchymal stem cell, JMMSC)可以转移到伤口部位，源于MSC外泌体的miR-223通过靶向下调pknox1蛋白表达，促进巨噬细胞向M2极化，加速伤口愈合[38]。

在避免感染的基础上恢复血供是细胞再生的关键，解决缺氧所带来的功能障碍，才能激活伤口周围细胞功能，组织工程上现在常用的方法是使用生物支架。Wang等[39]通过利用席夫碱可逆断裂连接的特性，连接构建负载有外泌体的高效可自修复的甲基纤维素-壳聚糖水凝胶，可以促进伤口血管生成并抑制细胞凋亡。有证据表明，ADSC-Exo对各种类型的缺血性疾病具有治疗效果，并且在缺氧刺激下ADSC-Exo具有很强的促进血管再生的能力[40]。Hu等[41]将缺氧预处理的ADSC-Exo包埋在甲基丙烯酰化明胶中，在光照下迅速由液态转化为凝胶状态，从而适应糖尿病患者的不规则伤口部位。

此外，在伤口愈合期间，周围正常组织的真皮成纤维细胞和人永生化角质形成细胞(HaCaT)会迁移增殖，分泌胶原纤维等，MSC-Exo可以促进这一过程。Hu等[42]发现ADSC-Exo可以优化成纤维细胞特性来促进皮肤伤口愈合。在伤口愈合早期刺激细胞迁移、增殖，增加胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ的合成和N-钙黏蛋白、细胞周期蛋白-1、增殖细胞核抗原(proliferat-ing cell nuclear antigen, PCNA)的基因表达；但在晚期，会抑制胶原蛋白表达，减少瘢痕的产生[42]。也有研究发现，人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell, hucMSC)衍生的外泌体可以促进热应激反应后创伤皮肤的上皮再生。通过其中的Wnt4激活Wnt/β-catenin和AKT通路，减少HaCaT凋亡，促进皮肤细胞的增殖和迁移，增加体内角质蛋白19片段、PCNA、Ⅰ型胶原的表达[43]。

颌面部皮肤除了愈合还要考虑美观性问题，即最后的重塑阶段加以干预，减少真皮组织过度纤维化，避免增生性瘢痕形成。MSC-Exo可能会进一步减少瘢痕形成。有研究表明，ADSC-Exo通过miR-192-5p靶向IL-17受体，调节增生性瘢痕纤维化中的Smad通路，可减轻胶原沉积、成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化以及增生性瘢痕的形成[44]。另外，对MMP的控制释放也有助于调控细胞外基质的重塑，促进皮肤无瘢痕修复。已有报道，ADSC-Exo通过激活ERK/MAPK途径增加MMP3表达，并调节胶原蛋白Ⅰ与胶原蛋白Ⅲ、TGF-β3与TGF-β1比例，有利于细胞外基质重塑[45]。

5、外泌体与神经组织再生

颌面部外周神经损伤后只能有限修复，缺乏持续性再生能力。而越来越多的证据表明，外泌体是外周神经再生的重要介质。外周神经的神经纤维是由多个神经元轴突聚集形成。施万细胞包绕轴突形成髓鞘、营养和支持轴突的发育成熟，在外周神经轴突再生中有重要作用，是外泌体的作用靶细胞。

研究发现外周神经损伤后，施万细胞去分化为祖细胞，引导轴突再生靶方向，并分泌外泌体与轴突通信。这些外泌体被轴突特异性内吞后，其中的miRNA将生长锥形态转变为促再生表型，并降低GTP酶RhoA的活性，从而抑制生长锥塌陷和轴突收缩[46]。有研究设计了一种负载BMSC-Exo的导电神经水凝胶(electroconductive hydrogel, ECH),可以治疗糖尿病周围神经损伤，起到抗炎镇痛、减轻肌肉萎缩、功能恢复的疗效。其中，ECH-Exo通过MEK/ERK途径促进施万细胞增殖迁移，增强轴突再生；同时，也通过NF-κB促进M2巨噬细胞极化，减轻炎症带来的疼痛[47]。也有研究发现，几丁质导管联合牙龈间充质干细胞(gingival mesenchymal stem cell, GMSC)外泌体可修复大鼠坐骨神经缺损，分析显示GMSC-Exo可促进施万细胞增殖和大鼠背根神经节髓鞘形成、轴突生长，与几丁质导管联合后可以增加神经纤维的数量和直径[48],这提示外泌体是一种新型的治疗外周神经损伤的方法。

此外，通过工程化改造外泌体内容物可以直接作用于神经元，促进其轴突生长。垂体腺苷酸环化酶激活多肽38(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide 38,PACAP38)是一种神经保护肽，使用大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell, RGC)外泌体递送PACAP38靶向至肽CP05,外泌体可促进轴突再生，并提高RGC存活率以及视网膜神经纤维层厚度，以恢复视神经功能[49]。

6、总结与展望

在过去30年中，外泌体在颌面组织再生领域的研究已取得了一系列重要成果，越来越多的研究证实其在促进血管生成、轴突生长、免疫调节、干细胞分化和药物递送中所发挥的重要作用。然而，直到现在仍存在许多未解决的问题和争议。首先，对于外泌体调控再生的具体分子机制与信号通路还有待继续深入研究。其次，关于外泌体收集、释放、应用的具体方式方法还缺乏深入研究，比如外泌体的扩大生产、刺激处理、释放后稳定性差、传递效率低等问题，这需要材料学、免疫学、生物化学等的不断发展和跨学科交叉融合，才能使得外泌体大量工程化和临床应用得以实现。解决这些问题不仅可以促进深入开展机制研究，对临床转化应用也具有重要意义。

基金资助:国家自然科学基金(82370927);

文章来源:刘可歆,郭佳,李蓓.外泌体在口腔颌面组织再生中的研究进展[J].口腔生物医学,2024,15(02):59-65.