摘要:目的:观察大鼠颌下腺放射后导致的氧化应激对细胞凋亡的影响。方法:24只大鼠随机分为对照组及放射24 h、72 h及1周组。对照组未照射,放射组右侧颌下腺进行一次性20 Gy照射,检测各组大鼠唾液分泌流率。苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察颌下腺组织形态改变;酶联免疫吸附试验法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测丙二醛(malondialdehyde, MDA)、还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)水平。免疫组织化学染色(immunol histochemistry, IHC)观察8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine, 8-OHdG)阳性表达;末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)检测颌下腺腺泡细胞凋亡情况;Western blot和实时定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测凋亡相关蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)、Bcl-2关联X的蛋白质(BCL2-associated X protein, BAX)及B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的蛋白及mRNA表达情况。结果:放射后大鼠唾液分泌减少;细胞内空泡化、组织水肿及间隙增宽等病理变化逐渐加重;细胞出现明显的氧化应激反应,并伴随出现细胞的凋亡;凋亡相关蛋白BAX、Bcl-2及Caspase-3蛋白及mRNA表达量异常。结论:放射后氧化应激反应可能是颌下腺细胞凋亡及功能障碍的重要影响因素。
头颈部癌症是全球第六大癌症,占所有癌症的5.3%[1],其治疗方法有手术、放疗及化学药物治疗。对于中晚期病人,放疗是主要的治疗手段[2]。由于唾液腺解剖位置接近于放疗术野,因此会导致唾液腺不可逆性损伤,使患者出现一系列口腔局部及全身性并发症[3],严重影响患者的生活质量。因此,对唾液腺放射损伤机制的研究为防治唾液腺分泌减少提供科学依据。虽然放疗导致唾液腺损伤的机制尚未明确,研究表明氧化应激和细胞凋亡与早期唾液腺放射损伤密切相关[4]。颌下腺作为第二大唾液腺,主要负责静息唾液量,对维持口腔湿润起重要作用。研究发现,颌下腺较腮腺对放射线更敏感[5]。因此,研究颌下腺放射损伤对放射性口干的治疗有重要临床意义。
活性氧(reactive oxygen stress, ROS)是由线粒体产生的氧代谢天然副产物。在正常生理条件下,ROS被细胞抗氧化防御系统去除[6]。ROS被认为是放射诱导正常组织损伤的重要原因[7]。研究表明,在18 Gy放射4 d后,大鼠颌下腺中诱导ROS产生的NADPH氧化酶2(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-2,NOX2)含量明显增加[8]。前期研究发现,大鼠颌下腺进行放射照射后,颌下腺组织中ROS产生增加,表现为颌下腺分泌量显著减少[9]。当细胞ROS产生过多时,会导致氧化应激,并通过线粒体诱导细胞的凋亡[10]。细胞凋亡被认为是唾液腺功能障碍早期的关键机制[11]。因此,本实验拟通过建立大鼠颌下腺放射损伤模型,观察ROS的变化及其对细胞凋亡的影响。
1、材料与方法
1.1 材料和设备
医用电子直线加速器(Elekta, 瑞典);Pilocarpine(MCE,美国);显微镜(OLYMPUS,日本);丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)试剂盒(伊莱瑞特生物,中国武汉);脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)试剂盒(弗瑞思生物,中国南京);蛋白提取试剂盒(索莱宝,中国武汉);二喹啉甲酸(Bicin-choninic Acid, BCA)试剂盒(ThermoFisher, 美国);一步法10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝胶快速制备试剂盒(博泰斯,中国北京);聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜(Immobilon, 爱尔兰);电化学发光显色液(Biosharp, 中国北京);含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)抗体(CST,美国);Bcl-2关联X的蛋白质(BCL2-Associated X protein, BAX)抗体(CST,美国);B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗体(武汉三鹰,中国);β-肌动蛋白(beta-actin, β-actin)抗体(Bioss, 中国);8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine, 8-OHdG)抗体(CST,美国);兔二抗(Bioss, 中国);5× All-In-One RT MasterMix试剂盒、EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-Low Rox试剂盒(abm, 加拿大);RT-qPCR仪(Bio-Rad, 美国);Real Time PCR instrument(ABI,美国)。
1.2 方法
1.2.1 大鼠颌下腺放射模型的构建
体重240~270 g大鼠随机分为对照组及放射24 h、72 h和1周组,各组6只(购于新疆医科大学动物实验中心)。用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射进行麻醉。放射组用医用直线加速器照射右侧颈部颌下腺区域(暴露区大小:15 mm×20 mm),其余部位用3 mm铅板遮挡。参照文献[12]方法一次性给予20 Gy剂量(剂量率:4 Gy/min; 源皮距:95 cm; 能量:6 MeV)。实验由新疆医科大学动物伦理委员会批准,批准号:IACUC-20211224-38。
1.2.2 唾液分泌量检测
所有大鼠在同一时间点按一次性20 Gy剂量进行照射。照射后24 h、72 h及1周对相应大鼠进行麻醉。麻醉起效后,腹腔注射2 mg/kg Pilocarpine刺激唾液分泌。随后用干燥棉球擦干大鼠口腔,另取预先称重的干燥无菌棉球置于颌下腺导管口,大鼠置于头低位收集唾液。10 min后取出棉球并迅速放入0.2 mL无菌无酶离心管称重。重复收集2次,间隔10 min。比较棉球重量差值,得出平均值,计算唾液流率(mg/min)。
1.2.3 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)及免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)染色
颌下腺组织经10%中性甲醛固定后石蜡包埋制片。HE染色观察组织形态变化。IHC染色:室温脱蜡,修复抗原,山羊血清封闭30 min, 阻断非特异性染色后使用8-OHdG抗体孵育过夜,室温孵育二抗20 min。Image-J软件检测阳性表达,计算累积光密度值(integral optical density, IOD)/面积比值。
1.2.4 酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)
适量颌下腺组织用PBS匀浆后收集上清液,并采用商用生化试剂盒检测颌下腺组织中氧化应激指标SOD、MDA和GSH水平。比较样本吸光度(A)值与标准曲线,计算样本浓度。
1.2.5 TUNEL染色
石蜡切片常规脱蜡,并按照TUNEL试剂盒操作要求对切片进行染色。
1.2.6 Western blot
颌下腺组织加蛋白裂解液于冰浴中匀浆。12000 r/min 4 ℃下离心5 min后收集上清。30 μg蛋白质在10%SDS-PAGE胶中进行电泳,PVDF膜湿转1 h, 脱脂牛奶封闭,用5%BSA溶液稀释,并孵育抗体Caspase-3(1∶1000)、BAX(1∶1000)、Bcl-2(1∶2000)及β-actin(1∶5000)4 ℃过夜。室温孵育二抗1 h。检测目标条带,Image J软件量化波段灰度值,计算与β-actin的相对比值。
1.2.7 RT-qPCR检测
常规用TriZOL提取组织总RNA,按照反转录试剂盒操作步骤进行基因组DNA的去除及cDNA 的获取,进一步配制荧光定量PCR体系(引物序列见表1),并进行对应基因的含量测定。结果均以Ct值表示,利用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。
1.2.8 统计学方法
数据以
表示。分析软件使用IBM SPSS23.0,多组比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD法。检验水准为α=0.05,以P<0.05为差异具有统计学意义。
2、结果
2.1 放射对唾液流率的影响
与对照组比较,放射各组唾液流率均明显降低(表2)。放射72h与24 h、1周与72 h相比,唾液流率下降,但差异无统计学意义;与放射24 h相比,1周组唾液流率减少29%(P>0.05)。
表1RT-qPCR引物序列表
2.2 放射对颌下腺组织病理学变化的影响
HE染色见图1。对照组颌下腺腺泡及导管分布均匀、细胞形态正常;放射24 h组腺泡呈巢状萎缩,并见少量细胞凋亡,细胞内见空泡化,腺泡间隙轻度水肿;放射72 h组腺泡萎缩及间隙增宽更明显,腺泡细胞空泡化更多,淋巴细胞浸润增多。放射1周组腺泡细胞内空泡增大,部分腺泡细胞内空泡融合成大空泡,间隙增宽加剧,形态不规则。
2.3 放射对颌下腺氧化应激指标的影响
与对照组比较,放射各组SOD、GSH减少;相比之下,作为氧化应激间接指标的MDA含量显著增多,差异均有统计学意义(P<0.05)。虽然SOD、GSH及MDA都呈现随时间变化的趋势,但差异没有统计学意义(P>0.05,表2)。对ROS诱导的DNA损伤标记物8-OHdG进行免疫组织化学染色,观察放射对氧化应激的影响(图1)。与对照组比较,放射各组8-OHdG阳性表达量明显增加(P<0.05);与放射24 h相比,1周组8-OHdG阳性表达量增加(P<0.05,表2)。
2.4 放射对颌下腺腺泡细胞凋亡的影响
为了观察放射对腺泡细胞凋亡的影响,对颌下腺组织进行TUNEL染色(图2)。结果显示,与对照组(0.506±0.341)相比,放射各组TUNEL阳性细胞的表达均明显增多(P<0.05);放射1周组TUNEL阳性细胞(3.371±1.379)相对于24 h(2.078±0.889)及72 h(1.840±1.045)组增加,差异有统计学意义(P<0.05)。
表2每组大鼠唾液流率,颌下腺组织MDA、SOD、GSH含量水平及8-OHdG水平比较
图1对照组及放射各组颌下腺组织HE染色及8-OHdG免疫组化染色(标尺:100 μm, ×400)
图2对照组及放射各组颌下腺组织TUNEL染色(标尺:100 μm, ×400)
图3对照组及放射各组颌下腺Caspase-3、BAX及Bcl-2蛋白水平
2.5 放射对凋亡相关分子表达的影响
为了更好地观察颌下腺中放射诱导的细胞凋亡,进一步在分子水平检测了凋亡相关分子Caspase-3、BAX及Bcl-2的含量。Western blot结果提示:放射24 h、72 h及1周组跟对照组相比,Caspase-3及BAX蛋白表达水平明显增高,Bcl-2表达水平降低,差异具有统计学意义(图3,表3)。RT-qPCR结果(表4)与Western blot结果保持一致。
表3各组大鼠颌下腺Caspase-3、BAX及Bcl-2蛋白水平比较
表4各组大鼠颌下腺Caspase-3、BAX及Bcl-2 mRNA表达量比较
3、讨论
头颈部放疗通常会引起放射性颌骨骨髓炎、放射性黏膜炎及放射性唾液腺炎等并发症。其中,放射性唾液腺炎在临床上最为常见[13]。目前认为放射导致唾液腺损伤的急性反应出现在放射后5~7 d内,主要包括ROS的产生、细胞凋亡、DNA损伤及Ca2+调控异常等[14]。 然而具体机制尚未明确。因此,本实验以细胞氧化应激为切入点,探讨放射诱导的ROS变化及对细胞凋亡的影响。
ROS在细胞信号传导和内环境稳态中发挥重要作用。细胞内氧化和抗氧化系统始终处于动态平衡,从而保护细胞由氧化物累积引起的损伤[15]。在电离辐射等外界因素刺激下,ROS急剧增加,并打破氧化-抗氧化系统之间的平衡,最终导致组织的损伤。有研究指出,用线粒体靶向抗氧化剂MitoTEMPO治疗颈部放射小鼠,能明显缓解唾液腺的损伤[16]。本课题组前期研究,选择一次性20 Gy剂量对大鼠颈部颌下腺区域进行照射[9,17]。根据唾液分泌功能及组织病理学结果发现,一次性20 Gy局部放射可诱导颌下腺分泌功能障碍和组织结构发生病理性改变。在此模型基础上检测氧化应激相关标志物,结果显示:放射后组织中自由基清除酶SOD及GSH明显降低、 脂质过氧化产物MDA显著升高,说明放射使抗氧化酶失去活性,诱导颌下腺组织发生氧化应激反应。
ROS的过度积累能使蛋白质、脂质和DNA氧化[18]。8-OHdG被认为是ROS导致DNA损伤的生物标志物[19]。Kim等[8]在接受放射后的腮腺腺泡细胞和导管细胞的细胞核中检测到8-OHdG阳性。HL-003通过调节ROS相关蛋白NOX4和8-OHdG的表达来降低受放射小鼠唾液腺中的氧化应激,并减少细胞凋亡[20]。本研究通过免疫组织化学染色对组织中8-OHdG进行检测,显示放射后组织中8-OHdG的表达明显高于对照组。此结果提示,ROS导致的DNA损伤可能是早期颌下腺放射损伤的重要原因。
细胞凋亡是机体内维持内环境稳态的重要生理机制。在放射过程中,ROS是诱导细胞凋亡的主要原因[21]。有研究者提出,在糖尿病模型小鼠中,高血糖诱导的ROS累积促进腺泡细胞的凋亡,并导致唾液分泌减少[22]。研究报道,烟酰胺通过使线粒体超微结构免受氧化损伤来减少放射诱导颌下腺腺泡细胞的凋亡[23]。此外,Meng等[24]发现抗氧化剂β-胡萝卜素通过减少鼻咽癌细胞中ROS的产生,并通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路抑制放射诱导的细胞凋亡。本研究为了探讨ROS与细胞凋亡之间的关系,通过TUNEL染色检测了组织中的凋亡水平,并通过Western blot和RT-qPCR检测了细胞凋亡分子的表达变化情况。结果显示,放射各组细胞凋亡水平明显高于对照组;促凋亡分子BAX及Casepase-3表达增多,抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少。因此推测,在放射诱导的组织损伤早期,过量产生的ROS导致细胞凋亡,从而引起颌下腺损伤。
本研究结果表明,放射后24 h、72 h及1周细胞内氧化应激水平升高,细胞凋亡水平也随之升高。但本研究尚未对氧化应激与细胞凋亡之间的相关机制深入研究。有研究指出,ROS通过核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)信号通路影响细胞的凋亡[25]。在牙周炎导致的肝损伤模型中,曹牛奔等[26]指出ROS通过JNK/NF-κB信号分子调控细胞凋亡。因此,在后续的研究中将着重探讨放射诱发颌下腺功能障碍早期模型中,过量产生的ROS与JNK/ NF-κB信号通路之间的调控关系,更加全面地阐述氧化应激与细胞凋亡之间的相关机制,从而为临床放射治疗及用药提供潜在的生物靶点。
参考文献:
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[12]张鹏鑫,麦麦提吐尔逊·阿布都乃比,吴言辉,等.放射后炎症反应对大鼠颌下腺紧密连接蛋白的影响[J].口腔医学研究,2023,39(5):416-421.
[26]曹牛奔,刘笑梦,邓愉,等.活性氧/c-Jun氨基末端激酶/核因子-κB信号分子通过调控凋亡参与牙周炎诱导肝损伤[J].华西口腔医学杂志,2022,40(5):532-540.
基金资助:“天山英才”医药卫生高层次人才培养计划(编号:TSYC202301A049); 新疆维吾尔自治区自然科学基金(编号:2022D01C119);
文章来源:麦麦提吐尔逊·阿布都乃比,热则耶·麦麦提祖农,张鹏鑫,等.放射后氧化应激对大鼠颌下腺腺泡细胞凋亡的影响[J].口腔医学研究,2024,40(07):605-610.
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2024-07-30我要评论
期刊名称:口腔颌面修复学杂志
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主管单位:北京市卫生局
主办单位:首都医科大学附属北京口腔医院,解放军总医院
出版地方:北京
专业分类:医学
国际刊号:1009-3761
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创刊时间:1999年
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