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经典Wnt信号通路对hDPSCs增殖、迁移和成牙本质向分化的影响

2020-09-18 291 上传者：管理员

摘要：目的:探究经典Wnt/β-catenin信号通路对人牙髓干细胞(hDPSCs)增殖、迁移、成牙本质向分化及矿化的影响。方法:筛选DKK1抑制Wnt信号通路的最佳浓度,并用该浓度处理hDPSCs。通过MTT和划痕实验观察细胞增殖和迁移能力的变化。碱性磷酸酶染色实验及WesternBlot分析DKK1对hDPSCs成牙本质向分化能力的影响。茜素红染色探究DKK1对hDPSCs矿化前期阶段矿化能力的影响。结果:(1)MTT实验结果显示,DKK1组在第5天时,hDPSCs的A值高于对照组(P<0.05)。(2)划痕实验结果显示,细胞从划痕边界不断向中间迁移,在24h时DKK1组细胞迁移距离明显大于对照组。(3)茜素红染色结果观察到,DKK1组可见多个大小不等的矿化结节。(4)Westernblot结果显示,DKK1上调DMP-1的蛋白表达。结论:抑制经典Wnt信号通路能够促进hDPSCs的增殖、迁移、成牙本质向分化及矿化。

关键词：
人牙髓干细胞
口腔医学
增殖
成牙本质向分化
迁移
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牙齿的发生、发育和形成是由上皮和外胚层间充质相互作用完成,目前的研究对牙齿发生的分子生物学机制尚未完全明确。Wnt基因家族共有19名成员,是由22个或24个Cys残基编码的进化保守的一种分泌糖蛋白,参与细胞形成、成熟和分化的不同阶段[1]。根据是否依赖β-catenin,将Wnt信号通路分为经典和非经典两种类型。众多研究显示经典Wnt/β-catenin信号通路在牙齿发育中发挥重要作用,上调Wnt信号通路不但可以增强牙周膜成纤维细胞的成骨分化[2],还能抑制成牙骨质细胞分化并促进其增殖[1]。然而该信号通路对hDPSCs的增殖、迁移及成牙本质向分化的影响仍需进一步研究。因此本实验通过经典Wnt信号通路的抑制剂Dikkopf-1(DKK1)探究该信号通路对hDPSCs增殖、迁移、成牙本质向分化及矿化的影响。

1、材料与方法

1.1材料和仪器

DMEM高糖培养基(Hyclone,美国),胎牛血清(Gibco,美国),庆大霉素,0.25%胰酶/EDTA(Gibco,美国),Dispase酶(罗氏,中国),Ⅰ型胶原蛋白酶(Sigma,美国),PBS粉末(博士德,中国),碱性磷酸酶(ALP)染色试剂盒(建成,中国),维生素K,β-甘油磷酸钠,DKK1(PEPROTECH,美国)。

1.2实验方法

1.2.1hDPSCs的分离与培养

收集16～24岁成人因正畸拔除的健康恒牙(哈尔滨医科大学附属第一医院口腔颌面外科门诊,通过哈尔滨医科大学附属第一医院伦理委员会许可)。采用酶消化法分离培养和鉴定hDPSCs[3],复苏前期冻存细胞,当细胞达到85%～90%融合时,以1∶3的比例传代,选择第4～5代的细胞用于所有实验。

1.2.2DKK1抑制Wnt信号通路的最适浓度

将第4代细胞按照1×105个/孔接种在6孔板中,待生长到60%～70%时,将质量浓度分别为0、20、80、100、150μg/L的DKK1分别加入培养板中继续培养,在48h后提取总蛋白,WesternBlot检测β-catenin蛋白的表达[4]。根据结果选择抑制效果最佳的DKK1质量浓度应用于后续实验。

1.2.3MTT检测hDPSCs增殖情况

实验分为2组,每组设置5个复孔,将第5代hDPSCs以5×103个/孔的密度接种于96孔板中。待细胞贴壁,在实验组中加入150μg/L的DKK1,37℃、5%CO2培养箱内培养1、3、5d后,每孔加入20μLMTT溶液(5g/L),继续培养4h后小心吸去孔内培养液,每孔加入150μL二甲基亚砜,置摇床上低速震荡10min,使结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm波长处测各孔A值。

1.2.4划痕实验

取第5代细胞接种于6孔板中,每孔1×105个细胞,加入含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM,37℃、5%CO2培养箱内培养。待细胞贴壁密度达到100%时进行划痕,PBS冲洗3遍,在实验组中加入150μg/L的DKK1(不含血清)继续培养,对照组更换为不含血清的DMEM,放置在37℃、5%CO2培养箱内继续培养,于0、2、6、24h在显微镜下观察细胞迁移距离并拍照记录。

1.2.5碱性磷酸酶染色

实验分两组,每组取第4代细胞接种于6孔板中,每孔1×105个细胞,细胞融合50%时,在实验组中加入150μg/L的DKK1。矿化诱导7d后对hDPSCs进行碱性磷酸酶染色。弃掉孔内原培养液,细胞用4%多聚甲醛固定30min后用PBS洗涤。根据说明书配制BCIP/NBT染色工作液加入各组孔板中,确保覆盖细胞。避光,室温孵育30min或更久,直至显色,拍照记录。

1.2.6蛋白免疫印迹实验

实验分两组,每组取第4代细胞接种于6孔板中,每孔1×105个细胞,细胞融合60%～70%时,在实验组中加入150μg/L的DKK1。矿化诱导7d后提取蛋白。PBS冲洗3次,RIPA及PMSF冰上裂解40min,4℃离心取上清液,使用BCA测定法(博士德,中国)测出提取的裂解物的蛋白质浓度。将各组细胞提取的蛋白放入100℃沸水中煮5min使其变性,蛋白上样量均为25μg,10%凝胶电泳,将电转后的PVDF膜用含有脱脂乳的TBST室温封闭1h,分别加入兔抗人Wnt3a、DMP-1、β-catenin单克隆抗体和兔抗人β-actin多克隆抗体,4℃过夜后漂洗,将膜在二抗中孵育1h,应用ECL化学发光试剂盒将膜在凝胶成像系统中显影,分析Wnt3a、DMP-1及β-catenin的蛋白表达情况。

1.2.7茜素红染色

将第4代hDPSCs接种于6孔板中,每孔1×105个细胞,细胞融合到50%在实验组中加入150μg/L的DKK1。矿化诱导7d后进行茜素红染色,细胞用4%多聚甲醛固定30min后用PBS洗涤。0.1%茜素红-Tris-HCl(pH=8.3)37℃孵育30min,PBS洗涤,干燥,拍照,观察矿化结节形成的情况。

1.2.8统计学分析

数据采用GraphPadPrism7软件进行独立样本t检验和单因素方差分析。所有实验独立重复3次,实验数据以x±s表示,P<0.05认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1DKK1对β-catenin蛋白表达的影响

WesternBlot检测结果显示,与对照组相比DKK1质量浓度在20、80μg/L时,β-catenin的蛋白表达呈浓度依赖性上调趋势。在DKK1浓度为150μg/L时,β-catenin蛋白表达显著降低(P<0.0001),表明150μg/L的DKK1能有效抑制hDPSCs中β-catenin蛋白的表达。因此本实验选用150μg/L的DKK1用于后续实验(图1)。

2.2DKK1对hDPSCs增殖能力的影响

MTT结果显示,虽然DKK1组在第1、3、5天的A值均大于对照组,但是仅在第5天,DKK1组的A值显著高于对照组(P<0.0001,图2)。说明在第5天时DKK1组的hDPSCs的增殖能力强于对照组,表明在第5天时DKK1能够促进hDPSCs的增殖。

图1不同浓度DKK1对β-catenin蛋白表达的影响

图2DKK1对hDPSCs增殖的影响

2.3DKK1对hDPSCs迁移能力的影响

划痕实验结果显示,0h、2h观察细胞划痕宽度基本一致。随着时间增长,6h两组细胞均向划痕处迁移,24h观察DKK1组细胞迁移距离明显大于对照组。由此可见DKK1组细胞迁移能力明显高于对照组,表明DKK1可促进hDPSCs迁移(图3)。

2.4DKK1能够抑制Wnt信号通路并促进hDPSCs成牙本质向分化

细胞矿化诱导7d后,ALP染色可见DKK1组中细胞与对照组相比染色加深(图4)。Westernblot结果显示,DKK1组Wnt3a及β-catenin的蛋白表达均低于对照组(P<0.05),证明DKK1能够抑制hDPSCs中的Wnt信号通路。与对照组相比,DKK1组中DMP-1的蛋白表达上调(P<0.0001),表明DKK1能够促进hDPSCs成牙本质向分化(图5)。

图3划痕实验。0、2、6、24h观察细胞迁移情况

图4ALP染色

图5DKK1对β-catenin、Wnt3a和DMP-1蛋白表达的影响

2.5DKK1对hDPSCs矿化前期阶段矿化能力的影响

在细胞矿化诱导7d后,茜素红染色显示,与对照组相比DKK1组可见多个染色较深且大小不等的矿化结节(图6)。

图6第7天茜素红染色(×10)

3、讨论

hDPSCs由Gronthos等[5]在2000年首次于第三磨牙的牙髓组织中成功分离,具有高水平的克隆形成能力和增殖能力[6]。有研究表明,hDPSCs能够分化为脂肪细胞、成牙本质细胞、成骨细胞、软骨细胞等,具有高度的可塑性[7]。由于伦理争议和免疫原性较低,hDPSCs较其他成体干细胞更易获得,因此成为组织工程及牙齿再生研究的理想种子细胞之一[7,8]。

Wnt信号通路是一个复杂的蛋白质作用网络,可参与调控细胞的增殖、分化、极化、凋亡与抗凋亡过程。激活经典Wnt信号通路可以促进根尖乳头干细胞的增殖和成牙及成骨向的分化[9],但是却抑制牙周膜干细胞及牙髓干细胞的成骨向分化的能力[10]。本实验将研究DKK1抑制经典Wnt信号通路后对hDPSCs增殖、迁移、成牙本质向分化及矿化的影响。

Dickkopf家族在进化中高度保守,DKK1作为该家族重要组成成员,是经典Wnt信号通路的抑制剂[11]。DKK1可以通过调节细胞增殖、迁移、分化,从而调控机体生长发育和疾病发展等生物学功能。DKK1通过与Lrp受体结合并阻断Wnt与受体结合来控制Wnt信号的传导。有报道称,DKK1能够增加大肠上皮细胞的增殖,这与β-catenin转录活性的增加有着密切的关系[12,13]。Fezza等[13]研究发现,重组DKK1通过重塑肿瘤微环境并诱导促炎细胞因子的分泌来促进肿瘤的侵袭和迁移。本实验选择经典的Wnt信号通路作为基础,采用质量浓度为150μg/L的DKK1对hDPSCs进行干预。Wnt通路活化的标志是细胞质β-catenin水平的升高。为了证明DKK1能够抑制hDPSCs中的Wnt信号通路,本文采用Westernblot方法检测Wnt3a、β-catenin的蛋白表达,结果表明DKK1可以下调hDPSCs中β-catenin及Wnt3a的蛋白表达从而抑制Wnt信号通路。MTT实验结果显示第5天DKK1组中hDPSCs的A值比对照组高(P<0.05),表明DKK1促进hDPSCs的增殖。划痕实验结果显示,用DKK1培养24h后的hDPSCs迁移距离大于对照组,表明DKK1促进hDPSCs迁移从而说明Wnt/β-catenin信号通路抑制hDPSCs的迁移。

DKK1主要在牙齿发育过程中间充质来源的组织中表达,对牙齿形成和牙冠形态变化非常重要[14]。有报道称,DKK1抑制Wnt/β-catenin信号传导可阻断骨髓基质细胞中的成骨细胞分化[15]。DKK1在牙髓和成牙本质细胞中的过表达会影响下颌磨牙牙本质的形成,说明DKK1通过抑制Wnt/β-catenin信号通路从而在牙齿的形成中发挥积极作用[16]。茜素红结果显示,在矿化诱导第7天时,DKK1组中hDPSCs形成的矿化结节增多,表明在hDPSCs矿化诱导前期,DKK1能够促进细胞矿化。

研究表明,Wnt信号通路参与成骨和成牙向分化。Cho等[17]报道高度表达的Wnt3a能使骨生成过程中的骨髓间充质干细胞基质的钙化进程减慢。本实验Westernblot结果表明DKK1增强hDPSCs中DMP-1的蛋白表达。有研究报道,ALP是参与骨等矿化组织代谢和再生的一种标志酶,在hDPSCs分化和基质矿化过程中起到十分重要的作用,其活性增高可能是hDPSCs分化的早期标志[18]。本实验ALP染色结果显示,DKK1组细胞染色较对照组颜色深。证明抑制经典Wnt信号通路能够促进hDPSCs的成牙本质向分化,这与Schelle等[19]的结果一致。

有研究发现,激活Notch/Wnt信号通路可以增强DPSCs的干性[20,21]。然而本实验证明经典Wnt信号通路抑制hDPSCs的增殖、迁移、成牙本质向分化及矿化。与上述文章结论存在差异的可能原因是:(1)本实验仅研究经典Wnt信号通路对hDPSCs的影响,而上述文章研究的是Notch/Wnt信号通路,二者相互作用于DPSCs可能会影响其作用效果。(2)Wnt信号通路作用于DPSCs的调节方式不同。(3)DKK1抑制Wnt信号通路的传导机制不同。Wnt信号通路及其下游的信号调节机制还有待进一步研究。

综上所述,通过DKK1抑制经典Wnt信号通路可以促进hDPSCs的增殖、迁移、成牙本质向分化及矿化。为进一步阐明hDPSCs成牙本质向分化的分子机制提供了实验基础。

参考文献：

[3]肖婉鲁,潘爽,牛玉梅.载柚皮苷胶原蛋白凝胶对人牙髓干细胞增殖的影响[J].口腔医学研究,2019,35(6):541-545.

[4]李书琴,杨珊,任嫒姝.张应力刺激下Wnt/β-catenin信号通路对成牙骨质细胞Runx2表达调控的体外研究[J].华西口腔医学杂志,2015,33(1):35-39.

[18]张晓艳,李小彤,曾祥龙.矿化液诱导人前磨牙牙髓干细胞向成骨细胞样细胞的分化[J].上海口腔医学,2010,19(4):398-402.

关孟莹,何丽娜,潘爽,李艳萍,刘会梅,牛玉梅.经典Wnt信号通路对hDPSCs增殖､迁移和成牙本质向分化的影响[J].口腔医学研究,2020,36(09):861-865.