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Zfp260对MC3T3-E1细胞体外成骨分化及增殖、迁移影响的实验研究

2025-01-06 21 上传者：管理员

摘要：目的：探究锌指蛋白260(zinc-finger protein 260,Zfp260)对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(mouse embryo osteoblast precursor cells,MC3T3-E1 cells)体外成骨分化及增殖、迁移的影响。方法：体外培养并诱导MC3T3-E1细胞成骨分化，实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测诱导7、14 d后Zfp260的表达量变化。用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染MC3T3-E1细胞，并通过RT-qPCR测定Zfp260的敲降效率及敲降组与对照组碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、人骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)等成骨生物标志物表达量的变化。通过Transwell、细胞划痕实验检测敲降Zfp260后MC3T3-E1细胞迁移能力的变化。通过CCK8实验检测敲降Zfp260后MC3T3-E1细胞增殖能力的变化。结果：体外诱导MC3T3-E1细胞成骨分化后，Zfp260的表达量明显上调（P<0.05）。使用siRNA敲降Zfp260后，ALP及BMP2的表达量明显下调（P<0.05）。Transwell及细胞划痕实验证明敲降Zfp260后，MC3T3-E1细胞的迁移能力受到抑制。CCK8实验证明敲降Zfp260后，MC3T3-E1细胞的增殖能力增加。结论：Zfp260可促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。

关键词：
小鼠胚胎成骨细胞前体细胞
成骨分化
成骨细胞
结节
锌指蛋白260
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成骨细胞的分化对种植体的骨结合起到重要作用[1]。小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1cells）是一种成骨细胞系，来源于新生小鼠的颅骨，在合适的培养条件下，MC3T3-E1细胞在体外可经历从增殖到结节形成再到矿化的过程，与体内的成骨过程相似[2-3]。

锌指蛋白260(Zfp260）属于Kruppel家族，含有13-锌指，可以调控心肌肥厚[4]。研究[5]发现，Zfp260可以在心肌细胞中上调转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1）及Ⅰ型胶原蛋白（collagen typeⅠ，COL1）的表达；还有研究[6]表明，TGF-β1能促进成骨细胞的分化。但是Zfp260是否对成骨细胞的分化具有影响尚不明确。因此，本研究旨在通过在MC3T3-E1细胞中对Zfp260进行沉默，观察MC3T3-E1细胞分化、增殖、迁移能力的变化。

1、材料和方法

1.1试剂和仪器

α-MEM培养液、胰蛋白酶、Opti-MEM™Ⅰ减血清培养液（Gibco公司，美国）；胎牛血清（BI公司，以色列）；青霉素、链霉素混合液（Hyclone公司，美国）；成骨诱导液（赛业生物科技有限公司，中国）；引物（北京擎科生物有限公司，中国）；生理盐水、无水乙醇、氯仿、二甲苯、甲醇、异丙醇（国药集团化学试剂有限公司，中国）；DEPC水（生工生物工程股份有限公司，中国）；RNAiso Plus(Ta Ka Ra公司，日本）；4×Hifair®ⅢSuper Mix plus、Hieff®q PCR SYBR Green Master Mix（翌圣生物科技上海股份有限公司，中国）；Lipo-8000转染试剂、碱性磷酸酶（ALP）显色试剂盒、CCK8试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，中国）；小干扰RNA(si RNA）质粒（北京擎科生物有限公司，中国）；结晶紫染色剂（Sigma公司，美国）；细胞小室培养板（无锡耐思生命科技股份有限公司，中国）。

1.2实验方法

1.2.1 MC3T3-E1细胞培养

将MC3T3-E1细胞在90 mm培养皿中用含10%血清及1%双抗的α-MEM培养液培养，待细胞汇合度约为80%时，用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline,PBS）洗涤2遍，胰蛋白酶常规消化3 min,1 200 r/min离心5 min（离心半径10 cm），完全培养液重悬并以1∶3的比例传代。

1.2.2 MC3T3-E1细胞成骨诱导

接种3×105个细胞于6孔培养皿中，待细胞汇合度达80%左右，依据说明书，小心加入已预热至37℃的成骨诱导液，2～3 d换液1次。

1.2.3 MC3T3-E1细胞转染

转染前24 h，接种3×105个细胞于6孔培养皿中。转染前先换新鲜培养液，并准备1只1.5 m L EP管。加入375μL Opti-MEM™Ⅰ减血清培养液及300 pmol si RNA，轻轻吹打混匀，再加入12μL Lipo8000™转染试剂，用移液枪轻轻吹打混匀，室温孵育20 min。将上述混合物缓慢轻柔加入6孔培养皿中，每孔加入130μL混合液，设为敲降组。另设未转染组为对照组，48 h后实时定量聚合酶链反应(RT-q PCR)检测沉默效率。

1.2.4 RT-q PCR

将6孔培养皿置于冰上，PBS洗2遍，小心吸干PBS，每孔内加入1 m L TRIzol试剂并反复吹打后转移至1.5 m L EP管中。再向EP管中加入200μL氯仿，混匀后离心，吸取400μL上清液后加入400μL异丙醇混匀离心，弃去上清液，用75%乙醇洗涤沉淀2次，并将提取的RNA通过4×Hifair®ⅢSuper Mix plus逆转录为c DNA，以逆转录得到的c DNA为模板，采用Hieff®q PCR SYBR Green Master Mix进行RT-q PCR。引物序列见表1。

1.2.5 ALP染色

吸去12孔板内的原培养液，PBS冲洗3遍，4%多聚甲醛固定MC3T3-E1细胞30 min。吸去多聚甲醛，PBS洗3遍，每遍5 min，缓慢沿着孔板侧壁向每孔内加入500μL BCIP/NBT溶液，室温下避光染色1 h,PBS洗3遍，观察并拍照。

表1引物序列

Table 1 Primer sequences

1.2.6 Transwell迁移实验

待细胞在6孔培养皿中长满，用胰蛋白酶消化，无血清培养液重悬，调整细胞密度为1×105个/m L，并向Transwell小室中加入100μL细胞重悬液体，向下室中加入含20%血清的培养液600μL，注意保持下室内无气泡。培养24 h后，PBS洗涤3遍，多聚甲醛固定细胞20 min,0.1%结晶紫染色30 min,200倍显微镜下随机取得5个视野拍照并计数。

1.2.7 CCK8实验

将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞用胰蛋白酶消化重悬，调整细胞密度为2×104个/m L，接种至96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，并在培养箱内孵育7 d。每孔加入10μL的CCK8溶液，37℃孵育2 h后测量450 nm处每孔的吸光度值，根据测得的值绘制增殖曲线。

1.2.8细胞划痕实验

在6孔培养皿的背面用直尺划直线，每孔有5条横线穿过。接种MC3T3-E1细胞于6孔培养皿中，待细胞长满后用200μL的枪头垂直于所划的线做划痕。PBS洗去漂浮的细胞，继续放入37℃培养箱内培养，分别在0、24、48 h时间点取样，拍照，并计算3个时间点的划痕愈合率。

2、结果

2.1 MC3T3-E1细胞成骨诱导后Zfp260表达量的变化

对MC3T3-E1细胞进行体外成骨诱导，并在第0、7、14天提取细胞总RNA后用RT-q PCR检测Zfp260的表达。结果显示，随着MC3T3-E1细胞的诱导分化，Zfp260的相对表达量在7 d和14 d时升高（P<0.001，图1）。

2.2 Zfp260沉默效率检测

分别提取敲降组和对照组的细胞总RNA,RT-q PCR检测Zfp260的表达，结果如图2所示，敲降组的Zfp260相对表达量显著低于对照组（P<0.01),Zfp260的沉默效率约为48%，可以认为敲降组构建成功。

2.3敲降Zfp260对MC3T3-E1细胞成骨标志物表达的影响

对敲降组和对照组的MC3T3-E1细胞进行成骨诱导，并在诱导7、14 d时分别提取细胞总RNA。通过RT-q PCR检测到诱导7 d时的沉默效率为75%,14 d时为55%，在诱导7、14 d均检测到敲降组ALP、BMP2基因表达量的下调（P<0.01，图3）。

图1成骨诱导后Zfp260表达变化

图2 si RNA沉默效率

2.4敲降Zfp260对MC3T3-E1细胞增殖能力的影响

CCK8实验显示敲降Zfp260后，MC3T3-E1细胞的增殖能力有所上升，在第5天时2组间的差异有统计学意义（P<0.05，图4)

2.5敲降Zfp260对MC3T3-E1细胞迁移能力的影响

Transwell实验及细胞划痕实验结果显示，敲降Zfp260后，MC3T3-E1细胞的迁移能力减弱（P<0.01，图5、图6）。

2.6成骨诱导后ALP染色结果

在MC3T3-E1细胞成骨诱导第7天时进行ALP染色，结果显示敲降组相较于对照组，染色更浅（图7）。

图3成骨诱导7 d和14 d时Zfp260、ALP、BMP2基因表达量比较

图4 si RNA敲降后细胞增殖能力的变化

3、讨论

种植体的骨结合是决定种植长期疗效的一个关键因素，而骨结合的过程是由多种细胞共同参与组成的，其中成骨细胞的分化起到了重要作用[7]。在成骨细胞的分化过程中，有多种细胞因子参与其中，诸如ALP、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2）、TGF-β1等[8]。Salkin等[9]证实了TGF-β1可以促进干细胞的成骨分化和骨损伤的修复。Nam等[10]表明TGF-β可以在早期促进骨祖细胞的增殖与分化，在后期会抑制基质矿化。同时也有研究[5]表明Zfp260可以促进TGF-β1的表达，故推测Zfp260能影响成骨细胞的分化。

Zfp260作为Kruppel家族的一员，已被证实可以通过α1肾上腺素能信号通路调控心脏的发育[11-12]。本研究发现，随着Zfp260的沉默，MC3T3-E1细胞的分化迁移能力减弱，增殖能力有所上升，ALP、BMP2的表达量下调，初步证明Zfp260可能对MC3T3-E1细胞的成骨分化起到重要作用。该机制可能通过促进BMP/Smads信号通路的表达起作用。通过对不同成骨诱导天数的MC3T3-E1细胞中的Zfp260进行沉默，BMP2的表达量均会出现下调的现象；而BMP2属于TGF-β超家族，可以与细胞膜上的特异性受体结合，使得下游的Smads蛋白发生磷酸化，磷酸化的Smads蛋白会进一步促进一些成骨特异性转录因子的表达（如RUNX2、Osterix、ALP等），从而调控成骨分化[13-14]。因此，本研究推测在MC3T3-E1细胞中沉默Zfp260后，会抑制BMP2的表达，进而抑制RUNX2、ALP等一系列下游成骨分化相关分子，从而减弱MC3T3-E1细胞的成骨分化能力。

图5荧光显微镜观察敲降组和对照组迁移细胞情况

图6敲降组和对照组细胞划痕后0～24 h的生长情况

本研究存在一定的局限性：首先，本研究缺乏对Zfp260影响成骨细胞分化的具体机制的研究；其次，本研究主要从体外层面观察Zfp260对细胞的影响，后续还需进一步增加体内层面的研究。

综上所述，Zfp260对MC3T3-E1细胞的成骨分化起正向调节作用，未来可能成为促进种植术后骨结合形成的新靶点。

图7成骨诱导7 d后的ALP染色

参考文献:

[7]李效宇,蔡青,尹昭懿,等.种植体骨结合过程中免疫细胞作用的研究进展[J].中国口腔种植学杂志, 2021,26(3):196-201.

基金资助:国家自然科学基金(81600836);

文章来源:吴军,王佐林.Zfp260对MC3T3-E1细胞体外成骨分化及增殖､迁移影响的实验研究[J].口腔颌面外科杂志,2024,34(06):421-426.