血流感染是一种严重的临床疾病，具有急性发病、快速进展和高病死率的特点，对患者的生命安全构成严重威胁[1-2]。近年来，细菌对抗生素的耐药性不断升高，进一步加大了血流感染的治疗难度。因此，迅速提供患者细菌鉴定和药敏结果对于临床医生的治疗决策至关重要，尤其是当耐药菌引发血流感染时，药敏试验的快速性显得尤为紧迫[3]。然而，目前在直接药敏试验领域，缺乏标准化的操作流程和判读标准，导致其应用受到限制。为解决这一问题，美国临床实验室标准化协会(CLSI)和欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(EUCAST)已经发布相关指南，提供了针对阳性血培养标本的直接快速药敏试验操作标准，为临床提供了更快速、更准确的药敏信息[4]。国内外已经有一些研究对EUCAST血培养阳性瓶RAST方法进行了评价[5]。本研究旨在评估EUCAST血培养阳性瓶直接快速药敏试验在国内实际临床应用中的效能和应用价值，为国内临床实践提供有价值的参考。

1、材料和方法

1.1 菌株来源

在2022年1—12月期间，从我院收集阳性血培养标本。标本中涂片显示为单一革兰阳性球菌或革兰阴性杆菌， RAST检测后，经鉴定为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的样品纳入了统计。同时，剔除3d内重复送检的同种细菌及混合感染的标本。

1.2 仪器与试剂

Bact/Alert 3D血培养仪及配套培养瓶(法国生物梅里埃公司);VITEK2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪及配套试剂(法国生物梅里埃公司);哥伦比亚血琼脂培养基(江门市凯林贸易有限公司);M-H琼脂培养基(上海科玛嘉微生物技术有限公司);药敏纸片(意大利Liofilchem药敏纸片)。

1.3 方法

1.3.1 血培养阳性标本快速药敏试验。

一旦血培养报告阳性，立即从阳性培养瓶中取出培养物，并进行革兰染色。若镜下观察显示存在单一革兰阴性杆菌或单一革兰阳性球菌，此时应颠倒混匀血培养瓶，利用无菌注射器抽取2mL阳性血培养液，并置于无菌塑料管内备用。

本研究参考2022年EUCAST公布的阳性血培养液RAST方法进行。首先，从无菌塑料管中吸取100μL阳性培养液，并涂布于直径90mm的M-H平板上，确保涂布均匀。随后，按照标准药敏试验的操作，贴上相应的药敏纸片。

对于革兰阴性杆菌，所用药敏纸片包括：TZP(30μg/6μg)、CTX(5μg)、CAZ(10μg)、IPM(10μg)、MEM(10μg)、CIP(5μg)、LEV(5μg)、AK(30μg)、CN(10μg)、TOB(10μg)、SXT(1.25μg/23.75μg)。

针对革兰阳性球菌，则使用的药敏纸片为：CN(10μg)、DA(2μg)、NOR(10μg)、FOX(30μg)。

将涂抹好的M-H平板放入35℃的培养箱中进行温育。在4h、6h和8h±5min的时间点，打开培养箱，取出平板，并在反射光的照射下，从正面测量抑菌圈直径。如果实验需要持续超过8h, 应在16～20h之间，从平板背面用反射光测量抑菌圈直径。

根据EUCAST RAST判读标准，将快速药敏结果判定为敏感、耐药和技术不确定区(ATU)三类。值得注意的是，ATU是指敏感与耐药折点重叠的区域，其抑菌圈直径范围通常在1～3mm。由于孵育时间较短，敏感性菌株与耐药性菌株间的分离情况较差，在此范围内的判断具有一定的错误率。因此，对于落入ATU范围的结果不提供药敏结果的判读。

1.3.2 血培养阳性标本常规鉴定及药敏试验。

血培养仪发出阳性报警后，尽快取出阳性瓶，进行革兰染色并转种至相应平板，孵育时长18～24h。经孵育后从平板上分离出单个菌落，并制备成0.5McFarland浊度单位的菌悬液以进行后续实验。用Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪，搭配相应的鉴定卡和药敏卡(AST GN13),进行革兰阴性杆菌的菌株鉴定及药敏测试。对革兰阳性球菌同样使用Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪，并搭配鉴定卡和药敏卡(AST GP67),进行菌株鉴定及药敏测试。所有药敏测试结果均按照CLSI M100-S31的标准判读。实验过程中，以大肠埃希菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 29213作为质控菌株，以确保实验结果的准确性和可靠性。

1.3.3 药敏结果的分析。

药敏结果的区域直径在读取时可能呈现三种情况：未读取(由于菌落生长不良);已阅读但未分类(位于ATU区域中);或已读取并成功归类为敏感(S)或耐药(R)。需注意，处于ATU中的结果因未进行分类，故不参与误差计算。通过比较RAST药敏与常规药敏结果的一致性评估两者的关系。一致性的判断标准：(1)分类一致性(CA): RAST药敏测试结果与常规药敏测试的结果完全相符。(2)极重大误差(VME): 所谓“假敏感”现象，即常规药敏测试结果显示细菌为耐药，而RAST药敏测试结果显示为敏感。(3)重大误差(ME): 出现“假耐药”的情况，即常规药敏测试结果显示细菌为敏感，而RAST药敏测试结果显示为耐药。(4)小误差(mE): 这里指的是常规药敏测试结果为中介，而RAST药敏测试结果显示为敏感或耐药的情况。

1.4 数据收集和分析

本研究重点分析大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌的血培养阳性菌。同时，在8h内筛查携带ESBL的菌株。不符合研究标准的菌种将被排除。为深入分析数据，采用R Studio 4.3.1进行统计处理。计数资料采用χ2检验，P<0.05代表差异有统计学意义。

2、结果

2.1 RAST在不同时间点的抑菌圈量取能力

为了评估RAST方法在不同时间点对抑菌圈直径的可量取能力，对115株细菌进行分析。结果显示，随着时间的推移，RAST的抑菌圈直径可量取比例逐渐提高。具体而言，在4h、6h、8h及16～20h的时间点，其可量取比例分别为91.3%、99.1%、100.0%及100.0%。这强烈反映了RAST技术的准确性和稳健性，尤其是在较长时间点；同时从数据可以看出金黄色葡萄球菌在4h读取能力差。这些统计数据提供了明确的证据，证明RAST方法在大部分时间点能够准确地量取抑菌圈直径，进一步证明了其在临床实验室中的实际应用价值，见表1。

表1 RAST在不同时间点的抑菌圈量取能力

判读细菌药敏结果可得，所有抗菌药物在4h、6h、8h、16～20h时的RAST结果平均CA比例上升，ATU下降。其中16～20h细菌药敏结果的符合率最优，4h最差，6h和8h较为接近。4h、6h、8h、16～20h判读CA比例最高的药物分别为NOR、MEM和NOR、MEM和NOR、MEM和NOR,CA最低的为DA、DA、LEV、DA。见表2。

表2 115株测试菌RAST与常规药敏试验的符合率[株(%)]

2.3大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌各时间快速药敏结果比较

4h、6h、8h大肠埃希菌CA比例上升，ATU比例下降；4h、6h、8h、16～20h肺炎克雷伯菌CA比例和ATU比例下降；4h、6h、8h、16～20h金黄色葡萄球菌ATU比例均上升，CA比例在6h最低。组间比较基本无统计学差异(P>0.05)。大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌4h、6h、8h、16～20h的VME、ME、mE的误差率均分别符合≤1.5%、≤3.0%、<10%的要求；而金黄色葡萄球菌各时间段VME、ME均不符合要求，mE均符合要求。见表3。

表3大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌各时间药敏结果比较[株(%)]

2.4使用RAST方法筛选ESBL大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的准确性评估

用CTX在 4h、6h、8h筛选ESBL阳性大肠埃希菌的符合率均为100.0%,而CAZ符合率分别为75.0%、76.9%、74.1%;用CTX 在4h、6h、8h筛选ESBL阳性肺炎克雷伯菌符合率均为75.0%,而CAZ符合率分别为50.0%、25.0%、25.0%,见表4。

表4使用RAST方法筛选ESBL的大肠埃希菌和肺炎 克雷伯菌的准确性评估

3、讨论

3.1 RAST技术的总体评估

随着医疗技术的快速进步和耐药谱的变化，迅速获得准确的药敏信息在感染性疾病的治疗中越来越重要。在这种背景下，RAST技术应运而生，成为近年来的研究热点[6]。

RAST技术首先在其应用背景上展现了其不可替代的价值。在当前医疗环境中，多重耐药细菌的快速蔓延使得感染疾病的治疗愈发复杂，医生面临的是一个急需在短时间内做出准确治疗决策的情境[7]。RAST技术的出现为此提供了有效解决方案。相较于传统的细菌培养和药敏试验，RAST大幅缩短了时间窗口，使得阳性血培养结果可以在数小时内获得，为患者提供了早期、针对性的治疗方案。

而从技术角度看，RAST与传统药敏试验的最大区别在于它的“快速”特性。传统的药敏试验通常需要长时间的培养，以确保细菌生长到可检测的数量。而RAST技术通过直接从阳性血培养瓶中提取样本进行测试，跳过了长时间的培养步骤，从而显著缩短了结果获取的时间。这不仅为临床医生提供了更快速的治疗决策支持，也意味着患者可以更早地接受恰当的抗生素治疗，从而降低并发症的风险、缩短住院时间和降低医疗费用[8]。

RAST技术的优势不仅仅在于其速度，与传统方法相比，RAST还表现出了更高的准确性和一致性。这是因为RAST减少了由于样本处理、转移和长时间培养等过程中可能产生的细菌数量和活性的变异，从而更真实地反映了患者体内的实际感染情况[9]。

RAST不仅提供了快速、准确的药敏信息，还为患者带来了更为个体化、针对性的治疗方案，进一步优化了感染疾病的临床管理。

3.2 细菌种类在不同时间点下RAST的应用评估

本研究对RAST在不同时间点的抑菌圈量取能力进行分析，发现大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌细菌可量取抑菌圈直径比例在各时间段均较高，金黄色葡萄球菌除4h外其余时间可量取抑菌圈直径比例高。

在本研究中，采用了EUCAST RAST方法，对主要引起血流感染的三种细菌的抗菌敏感性进行了评估。结果显示，与常规方法比较，RAST在各时间的判定中与常规方法具有较高的一致性，满足CLSI M52及FDA标准，其中整体符合率超过90%[10]。大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌4h、6h、8h、16～20h的VME、ME、mE的误差率均分别符合≤1.5%、≤3.0%、<10%的要求；而金黄色葡萄球菌各时间段VME、ME均不符合要求，mE均符合要求。总体来说，EUCAST RAST方法在中国的应用对于缩短诊断时间和提高抗菌治疗的及时性具有潜在价值。

实验结果表明EUCAST RAST是一种可靠的方法，可快速确定引起血流感染的细菌对抗菌药物敏感性。该方法已在欧洲国家使用，并已显示可以将诊断时间缩短到大约20h, 从而减少住院时间和死亡率[11]。然而，中国尚未使用EUCAST RAST。中国目前的临床措施仍依赖于培养生长和商业AST来确定引起血流感染的细菌的抗菌敏感性，通常需要3d。替代使用RAST可以显著减少这一时间，并对抗菌治疗产生积极的临床影响，特别是对于可能呈现多重耐药表型的微生物[12]。

判读细菌快速药敏试验结果可得，所有抗菌药物在4h、6h、8h、16～20h时的RAST结果平均 CA 比例上升，ATU下降。其中16～20h细菌药敏结果的符合率最优，4h最差，6h和8h较为接近。4h、6h、8h、16～20h判读CA比例最高的药物分别为NOR、MEM和NOR、MEM和NOR、MEM和NOR。NOR在4h、6h、8h、16～20h符合率均达到100%,即成为药敏符合率最高的抗菌药物。CA最低的为DA、DA、LEV、DA。

由此可知，对于本次研究中测试的抗菌药物，RAST是一种可靠且实用的方法，可用于临床诊断它们的抗菌敏感性。

3.3 RAST技术的推广应用及研究的局限性与未来方向

RAST技术凭借其高度的准确性和快速性，在临床实验室中有着广泛的应用前景。考虑到我国大型医疗设施的分布情况和各地医疗资源的差异，RAST技术的简便性使其能够方便地在不同规模的实验室中推广。特别是在那些迫切需要快速、准确药敏信息以支持感染病例决策的地区，RAST技术无疑可以作为一个有效工具。

随着微生物耐药性的增加，寻找快速准确的药敏测试方法变得越来越重要。在这种背景下，RAST技术可能会经历进一步的创新和改进，使其在更短的时间内提供更为精确的结果。此外，RAST的简便性和低成本也使其在公共卫生领域具有巨大的应用潜力，特别是在疾病暴发或流行病防控中，为政策制定者提供迅速的信息支持[13]。

尽管本研究取得了一些有意义的结论，但也存在一些局限性。首先，由于样本量可能不足以全面代表中国的广泛地理和人口差异，这限制了研究结论的普遍适用性。其次，实验方法可能受到实验条件和设备差异的影响，这可能影响结果的可靠性。特别是，RAST技术需要在多个时间点读取数值，这大大增加了工作量；如果能配备自动读取的仪器，将大大简化操作流程。因此，未来的研究可以在优化RAST技术的同时，探索其在其他细菌或真菌中的应用，并考虑将其与其他现代生物技术，如基因测序等，结合起来，以提供更全面、深入的微生物诊断信息。

综上所述，EUCAST血培养RAST方法，大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌血培养标本快速药敏结果与常规结果一致性好，4h可作为RAST药敏判读的时间点。金黄色葡萄球菌生长速度较肠杆菌目慢，收集例数较少，导致VME、ME比例偏高，4h的可量取比例较低，建议在6h进行判读。

然而，考虑到研究的局限性，未来仍需要进一步的研究来优化和完善该技术。总体来说，RAST技术为临床医生提供了一个有效的工具，有助于快速制定感染治疗策略，从而改善患者的治疗效果和生活质量。

参考文献:

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基金资助:2022年度梅州市医药卫生科研课题(2022-B-55);

文章来源:巫益坷,谢桂扬,张慧珊,等.评价EUCAST血培养阳性瓶直接快速药敏试验的应用价值[J].医学理论与实践,2024,37(22):3803-3807.