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干斑法保存血浆中HBV、HCV、HIV病毒核酸及其保存效期研究

2024-12-02 114 上传者：管理员

摘要：目的:建立一种以干斑法为基础制作的血液采集卡保存血浆中病毒核酸的方法，通过建立阿伦尼乌斯方程，预测该种保存方法保存核酸的效期，并论证该种保存方法在血站留存血液样本进行核酸复测的可行性。方法:分别将HBV、HCV、HIV核酸阳性的血浆样本制备成保存卡，以干浆斑的形式进行保存；将制备的保存卡分别放置于37、45、50和55℃条件下进行加速保存实验，不定期取出各个温度条件下的保存卡片，进行核酸提取操作，纯化出待测核酸样本，进行后续PCR测试，并记录CT值；根据阿伦尼乌斯方程建立起失效时间与储存温度之间的模型，进而推测出血液采集卡在规定保存温度条件下保存核酸的有效期。结果:HBV、HCV、HIV 3种核酸阳性的血浆样本，在使用干斑法保存时，其保存效期与温度的回归方程分别为：y=-11546x+31.74、y=-12949x+36.88、y=-12204x+34.48,线性回归的相关系数r均>0.98。预测HBV、HCV和HIV 3种病毒核酸使用干斑法保存时，在4℃的保存温度下，其保存效期分别为20 792、19 289和14 285 d;在20℃的保存温度下，保存效期分别为2 135、1 502和1 289 d。结论:血液样本中常见的3种病毒核酸，使用干斑法保存时，在加速破坏实验中符合一级反应模式，核酸降解速度与保存的绝对温度之间的关系符合阿伦尼乌斯方程。经过该方程的推算，使用干斑法保存血浆核酸样本，在不高于20℃的保存条件下，核酸稳定性效期最低可达3.5年，基本可满足血站血液样本留样保存年限的要求。

关键词：
干斑法
核酸
稳定性
血液采集卡
阿伦尼乌斯方程
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在血站日常工作中，血浆(清)标本的保存已成为一项常规工作，可为追溯血液检测结果提供真实的依据。目前，血站普遍采用的标本保存方式主要包括血袋辫子、转移血浆至96孔深孔板以及分离胶管直接保存等多种方式[1]。2009年修订的《血站管理办法》中明确规定了血液标本需保存至血液成分使用后二年，这一规定主要针对酶联免疫吸附性试验(ELISA)标本，并不适用于核酸检测样本的保存。

核酸是由多种核苷酸合成的生物大分子物质，其作为生物遗传信息的携带者，是疾病诊断，遗传咨询和个体识别的可靠手段。但是核酸的性质极不稳定，其易受温度、湿度、紫外线、pH值、化学反应和酶解作用的影响而发生降解或变性。在血站日常检测工作中，HBV、HCV、HIV 3项的核酸检测是不可或缺的必检项目，但标本开盖检测后再次留样不能代表检测当时状态[2],无法对留样进行核酸复测。学者们尝试用一种核酸保存液保存核酸，以期延长核酸保存的效期。张召等[3]的专利提出了一种核酸保存液，能够在常温下维持核酸的稳定性，但有效期仅15 d,远不能满足血站对核酸样本留样的需求。鉴于此，本研究探索一种以干浆斑状态保存核酸的方法，旨在实现长期保存血液中核酸稳定性的需求。

为了探究血液采集卡对核酸的保护效果，本研究采用阿伦尼乌斯方程对样本进行实验。文献报道，对于较长效期产品有效期的确定，尤其在无法进行实时稳定性考核的情况下，阿伦尼乌斯方程是可靠方法[4-7],通过加速实验的方式，其对产品稳定性进行了评估，最终在较短时间内预估产品的效期。该方法已在体外诊断试剂效期的预测中得到应用[8]。

1、材料和方法

试剂与仪器

ABI Prism 7500 PCR仪(美国塞默飞);Smart32全自动核酸提取仪1台以及配套96孔板、套管(广州达安基因股份有限公司);广州达安基因股份有限公司生产的乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(202401001,20241003)、丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(202401001,20241017)和人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸测定试剂盒(202312002,20240906)以及与上述试剂盒配套的核酸提取试剂盒；北京望升伟业科技发展有限公司研发的血液采集卡。

血液采集卡制备

准确吸取150μl血浆样本(HBV、HCV或HIV核酸阳性)加入到血液采集卡的加样孔中，约1 min后将其放回原自封袋中密封存放。同一血浆样本同时制备多个保存卡，并分别放入到37、45、50和55℃的恒温箱存放进行加速处理。后续将不定期取出各个温度条件下的样本进行PCR测试，并记录CT值。

核酸提取

取出一片保存卡片，剪碎并放入1.5 ml离心管中，加入400μl保存卡消化液，旋涡震荡以充分混匀，之后将其放入金属浴中，在70℃下孵育20 min后，将液体全部转移至过滤离心管(无核酸吸附型)中，以2 000×g离心1 min,收集全部滤液，并将其全部转移至核酸提取试剂盒的加样孔中，按照试剂盒说明书进行核酸提取操作，最后纯化出100μl待测核酸样本，可直接进行后续PCR实验。

核酸浓度测试

按照核酸试剂盒说明书，在PCR仪上设置适当的核酸扩增程序进行PCR实验，结果以CT值的形式进行记录。

统计学分析

根据阿伦尼乌斯方程建立的条件，本实验设置了4个不同的实验温度，即37、45、50和55℃。在每个设定的温度条件下，对加速时间t(X)和CT值S(Y)进行回归分析，得到回归方程Y=kX+b。该回归方程的斜率k可反应在该温度条件下的反应常数，同时以核酸浓度下降0.5个LgC作为核酸保存失效的标准[6-7],换算为CT值的形式，核酸检测的CT值的增加应不高于1.66个CT,以此为标准可计算每个实验温度下的核酸保存效期D。通过对四个温度下所计算出的效期D的倒数取自然对数，即Ln(1/D),记为y,对4个温度的绝对温度取倒数，即1/T,记为x,对y与x进行线性回归分析，得到回归方程y=mx+n,该回归方程可以反应出保存温度与保存效期之间的关系，由此方程可推算出在实际保存温度(如4或20℃)条件下的血液采集卡对核酸的预计保存效期。

2、结果

不同温度下的测定结果

同一血浆样本同时制备多个保存卡，分别放入37、45、50和55℃的恒温箱存放进行加速处理。后续不定期取出各个温度条件下的样本进行PCR测试，记录CT值见表1。

加速时间与CT值的关系

对表1数据进行回归分析，得到S-t关系如图1所示，且二者为线性关系，斜率为k。

由核酸复制规律可知，当核酸经过第n个循环时，Cn=C1×(1+E)^n(其中：Cn扩增产物量，C1起始模板量，E扩增效率，n循环数)(通常E<100%)。理论上，假设初始模板量为C1个拷贝，酶的扩增效率100%,到达最大阈值约需要45个循环(达安试剂盒最大阈值为CT=45),即245=C1×2n,C1=245-n,两边取对数lgC1=(45-n)lg2。由此计算得：当核酸降解0.5lg (copies/mL)时，△n为1.660(非理想状态下，核酸的扩增效率<100%,那么△n>1.660,本文以最小△n值1.66作为保存失效的标准)。由上述S-t线性关系可得出该温度下的反应速率k,根据阿伦尼乌斯方程D=Ln(Ci/C1)/k,即D=△n/k,分别计算37、45、50和55℃对应的效期D(表2)。

根据表2的结果，对效期D的倒数取对数，即Ln(1/D),记为y,对绝对温度取倒数，即1/T,记为x,计算结果见表3。

对表3中二者进行回归分析，得出回归曲线(图2),确定对应的回归方程(表4)反应出核酸保存效期与绝对温度呈线性关系。各回归曲线的相关系数r均>0.98,说明保存温度与核酸保存效期之间符合阿伦尼乌斯方程的建立条件；经过计算可得，阿伦尼乌斯方程预测HBV、HCV和HIV 3种核酸在4℃条件下的保存效期分别为20 792天(约57年)、19 289天(约52.8年)、14 285天(约39.1年),20℃条件下的保存效期为2 135天(约5.8年)、1 502天(约4.1年)、1 289天(约3.5年)。

3、讨论

HBV、HCV和HIV病毒的传播途径广泛，包括输血、移植、注射等。其中输血传播曾是临床上的重大挑战。目前，血站血液筛查采用酶联免疫吸附性试验(ELISA)与核酸联合检测的策略。ELISA检测样本置于-20℃冰箱冻存，但研究表明，反复冻融可能会影响标本的生物活性，使用分装标本进行复检会影响结果的有效性[9],因此，在进行血液溯源时会对结果产生影响。相比之下，核酸检测因其高敏感性、特异性(>80%),能够直接检测病毒核酸，有效弥补了ELISA检测的不足[10]。由于早期核酸检测方法受限于灵敏度，因此难以完全检测出处于窗口期的感染者。近年来，随着分子诊断技术的快速发展，这一问题得以缓解，随之则聚焦于对核酸的保存条件和延长核酸保存的效期。核酸的完整保存可以进一步提高窗口期样本的检出率，减少临床输血事故的潜在危害；核酸保存效期的延长可以按需及时追溯样本的真实性。

本研究聚焦于血浆中乙肝、丙肝和艾滋病毒3种病毒核酸以干斑法为基础制作的血液采集卡的保存稳定性及效期。采用了行业内公认的阿伦尼乌斯方程模型进行效期推导。通过在不同温度(37、45、50和55℃)下对血液采集卡加速老化的实验，观察到随着时间的延长和温度的升高，保存卡中核酸量变化明显，表现为核酸量逐渐降低，且随着温度的升高，核酸降解速率加快，该变化符合阿伦尼乌斯方程的变化规律，表明核酸在保存卡中降解的反应属于一级反应，符合阿伦尼乌斯方程建立的条件。

HCV和HIV属于RNA病毒，由于其大部分是单链结构，相较于DNA更容易断裂出错，因此稳定性较差。HBV是一种DNA病毒，其双链结构通过氢键相连，特别CG之间的三条氢键，非常牢固，使得DNA不容易解旋，从而其具有较高的稳定性[11]。阿伦尼乌斯方程的推导结果也证实了该结论。经过推导，结果显示，该保存卡对血浆中的病毒具有很好的保护效果，根据该方程推算，使用血液采集卡保存血浆核酸样本，在不高于20℃的保存条件下，DNA病毒核酸的稳定性效期可达5.8年，而RNA病毒核酸稳定性效期较DNA短，但最低也可达3.5年，这一效期基本可满足血站血液样本留样保存年限的要求，弥补血清学检测病毒的不足，有利于监测重点经血传播疾病的血液残余风险，为追查溯源血液检测结果及血液安全监测提供真实有效的依据，可以更好地保证血站血液检测工作的质量，为血站提供有力的保障。当然，尽管阿伦尼乌斯方程作为一种研究产品有效期的理论是可靠的，但该血液采集卡的真实效期仍需要通过实时稳定性研究进行进一步验证。

参考文献:

1梁志豪,梁丽华,廖扬勋,等.采供血机构血清标本新保存管理模式的探讨.中国医药指南,2010,8(11):151-152.

2刘宜仲,黄守民,王瑛琨,等.血站核酸检测标本保存信息管理初探.中国输血杂志,2019,32(10):1070-1071.

3张召,嘉茵,马燕,等.一种核酸保存液及其制备方法和应用.广东省:CN112176025B,2022-05-24.

4董亚琳,董海燕,姚鸿萍,等.金裕星注射液稳定性及其有效期预测.中国现代应用药学,2003,20(2):163-164.

5汝玲,韩方璇,黄春新.经典恒温加速法和多元线性模型预测头孢米诺钠水溶液的稳定性.中国药房,2006,17(19):1500-1502.

8杨梅,刘君君,牟晓然,等.阿伦尼乌斯方程在体外诊断试剂有效期预测中的应用.国际检验医学杂志,2013,34(12):1586-1588.

9连斯敏,陈晓华,林树波,等.长期冷冻对ELISA法检测血浆标本中HBsAg结果的影响.中国输血杂志,2024,37(1):91-94.

10李燕,何燕琴.核酸检测联合ELISA检测在献血者血液筛查中的应用价值研究.江西医药,2021,56(12):2343-2344.

11冯丰,于建国,方维海.DNA和RNA双链稳定性差异的理论研究.高等学校化学学报,2009,30(12):2445-2451.

文章来源:张菁,邵春燕,任苓苓,等.干斑法保存血浆中HBV､HCV､HIV病毒核酸及其保存效期研究[J].中国实验血液学杂志,2024,32(06):1869-1874.