微量元素是人体生长代谢必不可少的重要组成部分，参与多种酶、激素、维生素和核酸等代谢过程，影响诸多疾病的发展和进程。了解人体内微量元素缺乏或蓄积中毒情况，可辅助临床制订诊疗方案，为特殊人群提供准确、快速的诊断依据。孕妇是最易发生微量元素缺乏的人群之一，主要由于胎儿需要从母体吸取更多的营养物质，因此微量元素的监测可作为评估孕妇营养状态的一项重要指标。CHOI等[1]通过研究发现，孕妇与一般人群相比，血液中的铜（Cu）和钴（Co）水平偏高，锌（Zn）、硒（Se）水平则偏低，并且Cu水平偏低与子痫前期患病率相关，维持Cu和Zn的最佳水平可降低自然流产率[2]。Fe和Zn水平降低合并有毒重金属元素存在时是先兆流产的重要诊断依据和预后评价指标[3]。近年来有研究显示，妊娠早期血清低水平Cu元素可能导致妊娠高血压的患病风险升高[4]。此外，孕妇体内微量元素的缺乏会引起免疫力下降、睡眠质量差、贫血等症状，甚至导致胎儿畸形等严重后果[5]，最终影响妊娠结局。因此，定期进行体内微量元素水平监测，有助于评估临床孕期女性的营养状况，辅助诊断与元素过量或缺乏相关的疾病，指导孕妇合理补充微量元素。

目前微量元素检测方法诸多，包括溶出伏安法[6]、X射线荧光法[7]、中子活化分析法[8]、原子吸收光谱法（AAS)[9]、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS)[10]等。其中ICP-MS将电感耦合等离子体的高温电离特性与四极杆的灵敏快速筛选扫描的优点相结合，具有超高灵敏度、多元素高通量检测等优势，可在几分钟内定量测定几十种元素，是现阶段研究人体元素含量最有效的工具之一，广泛应用于各类疾病的金属组学研究中。徐凤仙等[11]研究妊娠期女性5种微量元素在不同孕期的差异，曹清芸等[12]采用大样本量对不同孕期和年龄的孕妇的5种微量元素进行统计分析，指出需要重视孕期合理补充微量元素。但目前关于孕妇血液中19种微量元素的研究则鲜有报道。本研究参考美国临床和实验室标准协会（CLSI)EP系列文件和质谱应用共识对ICP-MS检测19种微量元素的性能进行评价[13,14]。此外，为了解孕妇体内微量元素的代谢特征，本研究对358例孕妇的微量元素进行分析，比较孕妇不同年龄段和不同孕期19种微量元素结果的差异，为孕妇微量元素的监测提供重要依据。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2019—2020年在本院产科门诊或妇科门诊就诊的孕妇358例作为研究对象，排除心、肝、肺等器质性疾病。孕妇年龄19～43岁，中位年龄30岁。根据年龄分为非高龄组孕妇（<35岁）285例和高龄组孕妇（≥35岁）73例；按照孕周分为妊娠早期组（<13周）276例和中晚期组（≥13周）82例。分析不同组别孕妇19种微量元素[锂（Li）、镁（Mg）、钙（Ca）、铬（Cr）、锰（Mn）、铁（Fe）、Cu、Zn、Se、锶（Sr）、钼（Mo）、镉（Cd）、汞（Hg）、铅（Pb）、钒（V）、Co、砷（As）、铊（Tl）、铋（Bi）]水平的差异。

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器

ICP-MS仪（美国安捷伦公司，Agilent7900），超纯水机（法国威立雅公司，PURELABChorus1），自动进样器（美国TeledyneCETAC,ASX-560），多管漩涡混合仪（杭州奥盛仪器有限公司，MTV-100），高纯氩气（Ar>99.999%）和氦气（He>99.999%，深圳高发气体），超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司，AS7240A）。肝素钠专用微量元素采血管（广州阳普医疗科技股份有限公司，2mL）。

1.2.2试剂

65%硝酸（MERCK,LC-MS级），曲拉通X-100和金离子标准溶液（Macklin，微量元素级别），多种微量元素标本稀释液（含质控、标准曲线和内标，杭州佰勤医疗器械有限公司），调谐液（美国安捷伦公司），实验用水由超纯水机制备（高纯水电阻率为18MΩ·cm）。

1.2.3仪器工作条件

等离子体气体15L/min，辅助气体1L/min，雾化气1L/min，补偿/稀释气体1L/min，雾化室温度2℃；IF/BK真空度1.99E+2Pa，射频功率1550W，八级杆偏转电压为-18V，采样深度8mm；校准方法采用标准加入模式，分别选用钪（Sc）、钇（Y）、铑（Rh）、铟（In）、铽（Tb）为内标元素。

1.3方法

采集孕妇静脉血2mL至微量元素专用肝素钠抗凝采血管中，标本稀释后即可进行ICP-MS分析。

1.3.1标本测定

打开仪器，待真空度达到要求，用调谐液调谐仪器各项指标，包括灵敏度、稳定性、背景、离子透镜调谐参数等，确保仪器各方面指标达到要求，再进行批处理前调谐，使响应计数、相对标准偏差（RSD%）、氧化物、双电荷、分辨率等均达到要求，将制备好的标液、质控、标本依次编号测定。取100μL充分混匀的血样或质控品加入3900μL标本稀释液，3000r/min振荡10min后进行ICP-MS分析。

1.3.2方法学评价

实验操作人员必须经过专业的仪器和项目培训，熟练掌握仪器的使用、维护，熟悉仪器各方面性能指标，按照《ISO15189:2012医学实验室质量和能力认可准则》的要求建立质量管理体系，对仪器进行定期校准、调谐和维护，规范工作流程，做好实验室各环节的质量控制，保证结果准确可靠。

1.3.3正确度

参考EP15-A3文件[13]，采用回收试验评价方法的正确度，根据厂商提供的质控物，选取19种微量元素低水平和高水平质控品混合血液标本，每个水平标本平行测定2次，连续分析5批（n=5），将制备好的样品由蠕动泵导入质谱仪，按照文件中1.3和1.4项下条件测定，计算高低水平10次结果的平均值、标准差（s）和根据实验数据计算出的验证区间，若厂家提供的靶值在验证区间内，说明正确度验证通过，若靶值不在验证区间内，则正确度结果不能通过验证。

1.3.4精密度

依据EP15-A3文件[13]，选取高低两个质控水平平行测定4次（n=4），连续测定5d，计算19种微量元素的、批内变异系数（CV）、实验室内不精密度（S）和总CV。批内CV和总CV≤厂家声明的要求（15%）为精密度满足要求。

1.3.5检出限和定量限

依据质谱应用共识和JJF1159-2006四极杆电感耦合等离子体质谱仪校准规范[14,15]，吸取21份4mL超纯水分别于5mL的Ep管中。将第1份超纯水空白经ICP-MS测定后作为背景响应，其余20份空白标本扣除第1份超纯水背景本底响应后，计算20份超纯水测定结果的3倍标准偏差作为检出限（LOD）。定量限（LOQ）是以10倍的标准偏差和线性水平最低点进行评估，而实际临床工作中结合临床参考范围，为满足正确度和精密度要求，将线性范围下限作为预估的定量限。将微量元素LOQ水平平行测定10次（n=10），计算19种微量元素的LOQ相对偏倚（Bias）和CV。定量限的Bias在±15%内，CV≤15%为满足要求，在此条件下，计算19种微量元素的LOD。

1.3.6线性范围

选取多种微量元素基底液（L0）、标准曲线L1～L6标液（由低水平到高水平6个水平点）从2～8℃环境取出恢复至室温，2000r/min离心，10min后直接进行ICP-MS分析，以标准溶液中各化合物的峰面积与内标化合物的峰面积的比值（相对响应比率）为纵坐标，以标准溶液中各化合物相应的水平为横坐标进行线性回归，获得各元素的线性回归方程和相关系数。若相关系数r≥0.995，说明19种微量元素的水平与相对响应比率线性关系良好。

1.3.7稳定性

稳定性对检测结果的可重复性、可靠性产生影响，可采用高、低水平考察19种微量元素不同储存条件下的稳定性。根据临床血液标本水平和标准物质添加法制备高、低水平微量元素混合血液标本，分别将低水平和高水平标本分装成30份，每份100μL。将混合血液标本分别放置冷藏（2～8℃，5d）和室温（20～26℃，3d），每种条件下每次分别取出6份（n=6），测定19种微量元素的低、高水平血液标本在冷藏条件下1、3、5d和室温条件下1、3d的结果，将第1天测试的结果作为初始测定值，计算19种微量元素的平均值，与初始测定值比较，Bias≤15%为符合要求。

1.4统计学处理

采用SPSS23.0软件对数据进行分析，正态分布计量资料采用表示，两组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布计量资料采用中位数和四分位数间距[M(P25,P75）]表示，组间比较采用非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1正确度

19种微量元素的正确度结果见表1，根据试验数据计算得出微量元素的验证区间，结果显示厂家提供的靶值在验证区间内，因此ICP-MS测定19种微量元素的正确度得到了验证，结果符合要求。

2.2精密度

ICP-MS检测19种微量元素高、低两水平的批内CV、实验室内CV、S和总CV结果见表2，批内和实验室内CV≤7.72%，符合试剂盒厂商验证要求。

2.3LOD与LOQ

ICP-MS测定19种微量元素的LOD与LOQ结果见表3,LOQ的Bias≤15%,CV≤13.46%,LOQ结果满足要求，在此条件下，19种微量元素的LOD见表3。

表1ICP-MS检测19种微量元素的正确度结果（n=5)

表2ICP-MS检测19种微量元素的精密度结果（n=4)

表3ICP-MS测定19种微量元素的线性范围、LOD和LOQ结果（n=10)

2.4线性范围

ICP-MS测定多种元素的线性范围结果见表3,19种微量元素的水平与相对响应比率具有良好的线性关系，r≥0.995。

2.5稳定性

ICP-MS测定19种微量元素的稳定性结果见图1，图中可见19种微量元素的Bias≤15%，因此检测微量元素的标本可冷藏保存5d、室温保存3d，水平未发生显著改变，满足实验室标本一般保存要求。

图1ICP-MS测定19种微量元素的稳定性（n=6)

表4ICP-MS测定358例孕妇19种微量元素水平的比较

2.6临床标本分析

结果显示，非高龄组和高龄组Mg、Tl水平差异有统计学意义（P<0.05），妊娠早期组和妊娠中晚期组Mg、Cu、Mn、Co水平差异有统计学意义（P<0.05），其他元素在年龄和孕周分组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

3、讨论

本研究参考ISO15189和CLSIEP文件中关于检测方法性能验证的相关内容对ICP-MS测定19种微量元素的分析性能进行系统性的评价。19种微量元素水平与相对响应比率在检测范围内具有良好的线性关系（r≥0.995）。通过对该方法正确度和精密度考察发现符合验证要求，在满足临床标本检测范围的前提下，LOQ符合要求，ICP-MS采用的标本冷藏和室温保存方法对19种微量元素标本进行检测具有良好的稳定性。此外，本研究以Sc、Y、Rh、In、Tb5种元素作为内标，在标本处理中采用直接稀释法可满足简便、快速测定微量元素的要求，可有效避免复杂前处理可能带来的标本损失和引入污染[16]。试验中所采用的标本量仅100μL，在2min内即可实现临床标本中19种微量元素的高通量准确测定。

在研究过程中发现，由于部分微量元素在人体内水平较低，易受多种因素影响，因此做好分析前、中、后的质量控制对于保证检测结果真实、可靠至关重要。有研究证实，采血管的选取对微量元素结果影响很大，主要是由采血管材质、抗凝剂、采血管帽中元素的残留等造成的[17]。有研究发现，检测前对实验室采血管进行本底值检测利于降低污染率[18]，若采血管中残留的目标元素低于血液微量元素最小值的10%或低于LOD则符合使用要求。在对实际临床标本进行检测的过程中还发现，Cr、Mo及Hg3种元素在检测中易残留，需采取措施来降低残留污染。本研究中采用的方法为在含有硝酸的洗针液中加入少量的金溶液和曲拉通，这有助于降低微量元素在清洗过程后的残留。试验过程发现Cr和Mo元素易受到外界环境干扰，本底空白的响应值增高可能影响质控和临床标本结果准确性，因此对这两种元素在临床标本中的含量进行测定时需要保证实验环境的洁净和无尘，并注意防潮，尽量避免引入外源性污染[10]。

为了拓展ICP-MS在临床检测中的应用，本研究采用该方法对收集到本院的孕妇全血标本进行检测，通过对不同年龄段和不同孕期孕妇研究发现血液中Mg元素水平差异有统计学意义（P<0.05）。高龄孕妇由于年龄较大，代谢速度有不同程度的降低，可能导致不同年龄段Mg元素的水平不同。从检测结果中可看出，处于妊娠中晚期的孕妇血液中Mg元素水平比妊娠早期略有降低，这可能是由于在妊娠中晚期胎儿在成熟过程中对Mg元素的需要量增加造成的，因此在妊娠中晚期需要适量增加一些富含Mg元素的食物，如蔬菜、坚果、谷类等的摄入。Tl元素是人体非必需微量元素，传统的检测方法难以监测，本研究利用ICP-MS检测发现该元素在高龄组与非高龄组血液中的水平差异有统计学意义（P<0.05），这种差异可能为不同年龄段孕妇体内的激素和代谢水平不同，或与环境接触污染及累积效应有关。有相关研究显示，随着工业的发展和人口的急剧增长，环境污染造成的体内重金属元素富集愈加严重，孕妇应避免接触重金属污染的环境，尤其是As、Mn、Pb、Cd等污染的地区[19,20]，因此对包括Tl在内的多种重金属元素在孕妇体内的水平进行检测，对保证孕期女性和胎儿的健康至关重要。本研究同时发现，妊娠中晚期组体内Cu元素水平高于妊娠早期组，差异有统计学意义（P<0.05）。有研究表明，妊娠期女性血液中的Cu元素水平明显高于非孕期，可能与妊娠期雌激素增高刺激肝脏合成铜蓝蛋白有关，或由于妊娠期典型的激素变化而导致胆道对Cu排泄减少[21]。此外，本研究发现处于妊娠早期和中晚期的两组孕妇血液中Mn元素水平差异有统计学意义（P<0.05）。有文献报道孕妇处于临近分娩时体内的Mn水平明显高于妊娠早期[22]，这与本研究的数据一致。由于Mn是人体必需微量元素，主要来源于食物、环境等，负责碳水化合物、氨基酸和胆固醇的正常代谢，孕期母体Mn元素的缺乏会导致新生儿发生支气管哮喘、软骨发育不良等后果，而过量的Mn元素则可导致孕妇头晕、乏力等症状，因此定期监测Mn元素是否存在缺乏或过量对孕妇的健康至关重要。本研究发现，妊娠早期与妊娠中晚期的女性体内的Co元素水平差异有统计学意义（P<0.05），妊娠中晚期高于妊娠早期，这与文献报道的结果一致[1]。Co是维生素B12的重要组成部分，能通过影响肾脏释放促红细胞生成素，刺激红细胞生成，是一种独特的营养物质，与体内激素和代谢物质有关，Co的过量摄入会导致呼吸困难、全身疲倦等。此外，孕妇在妊娠期不同阶段对微量元素的需求有所不同，这就需要通过精准、快速、准确的微量元素检测结果作为依据，从而为孕妇提供个性化的微量元素摄入指导，提示孕产妇应对自身营养进行合理补充，必要时进行药物干预。

4、结论

综上所述，ICP-MS在检测人全血中19种微量元素时具有良好的分析性能，具有精密度高、准确度好、线性范围宽，以及临床标本结果测定准确、可靠等优势，可用于大批量临床标本的检测。本研究发现年龄和孕周是导致孕妇体内部分微量元素水平产生差异的重要影响因素，探讨孕妇微量元素的水平变化有利于指导合理、及时补充微量元素，避免微量元素缺乏或过量中毒，降低妊娠期疾病和胎儿不良结局的发生率，对产前诊断具有重要价值。本研究中孕期女性微量元素水平检测的对象主要来自深圳市罗湖区，虽然对不同孕期和年龄的研究对象进行了研究但仍具有一定区域局限性，并计划在后期扩大样本量进行深入研究，进一步有针对性地评估孕妇营养情况、血清水平和妊娠结局之间的关系。

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基金:国家自然科学基金面上项目(81772921);深圳市基础研究自由探索项目(JCYJ20180306172209668);深圳市卫生和计划生育委员会学科建设能力提升项目(SZXJ2017018);深圳市医疗卫生三名工程(SZSM201601062)