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乳酸抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的研究

2024-11-11 141 上传者：管理员

摘要：目的探究乳酸对心肌成纤维细胞的纤维化表型的调节作用和可能机制。方法小鼠心肌成纤维细胞分为对照组（常规培养）、低剂量实验组(4 mmol·L-1L-乳酸)、中剂量实验组(8 mmol·L-1L-乳酸)、高剂量实验组(12 mmol·L-1L-乳酸)、转化生长因子-β1（TGF-β1）组(10 ng·mL-1 TGF-β1)、联合组(10 ng·mL-1 TGF-β1+12 mmol·L-1L-乳酸)和乳酸转运蛋白抑制药（CHC）组(3 mmol·L-1 CHC)。用蛋白质印迹法检测纤维化相关蛋白的表达水平以及泛乳酸化修饰（Pan Kla）和H3组蛋白K18位乳酸化修饰情况，用细胞划痕实验检测细胞的迁移能力。结果对照组、TGF-β1组、高剂量实验组和联合组的细胞迁移率分别为（40.56±0.03）%、（61.61±0.04）%、（26.59±0.05）%和（38.33±0.06）%,TGF-β1组、高剂量实验组的细胞迁移率和对照组相比较，TGF-β1组的细胞迁移率和联合组比较，在统计学上差异均有统计学意义（均P<0.01）。对照组、TGF-β1组、高剂量实验组、联合组的Ⅰ型胶原A1（COL1A1）蛋白相对表达水平分别为0.76±0.09、1.10±0.07、0.40±0.04和0.68±0.10,COL3A1蛋白相对表达水平分别为0.87±0.05、1.15±0.07、0.32±0.07和0.73±0.06,α-平滑肌肌动（α-SMA）蛋白相对表达水平分别为0.86±0.04、1.24±0.09、0.30±0.05和0.74±0.08,TGF-β1组、高剂量实验组的上述指标和对照组比较，TGF-β1组的上述指标和联合组比较，在统计学上差异均有统计学意义（均P<0.01）。对照组、高剂量实验组和CHC组小鼠心肌成纤维细胞的细胞迁移率分别为（62.60±6.50）%、（28.00±8.15）%和（39.40±4.50）%,COL1A1蛋白相对表达水平分别为1.10±0.07、0.49±0.04和0.34±0.06,COL3A1蛋白相对表达水平分别为1.04±0.10、0.60±0.20和0.37±0.03,α-SMA蛋白相对表达水平分别为1.20±0.11、0.67±0.20和0.48±0.18,Pan Kla蛋白修饰水平分别为1.06±0.07、1.54±0.09和1.53±0.12,H3K18la蛋白修饰水平分别为0.67±0.06、1.23±0.06和1.14±0.08,CHC组和高剂量实验组的上述指标与对照组比较，在统计学上差异均有统计学意义（均P<0.01）。结论 L-乳酸可能通过增加非组蛋白乳酸化修饰和H3K18la修饰来发挥抑制小鼠心肌成纤维细胞纤维化表型的作用。

关键词：
L-乳酸
MF
乳酸化修饰
心肌成纤维细胞
心肌纤维化
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心肌纤维化(myocardial fibrosis, MF)心肌损伤时，心肌成纤维细胞激活并转分化为肌成细胞，分泌大量的细胞外基质而过度堆积，导致心肌组织结构破坏和功能障碍[1-2]。MF在初期可以防止心脏的破裂，但长期的纤维化会加剧心肌缺血以及心脏负荷，最终引发心力衰竭。乳酸是糖酵解的产物，近年来研究表明，乳酸及乳酸化修饰在代谢调控、癌症、炎症反应中发挥重要调节作用[3]。研究表明，肺纤维化患者的乳酸含量升高，并且乳酸通过pH依赖来激活转化生长因子(transforming growth factor, TGF),从而使得肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，加剧肺纤维化进程[4]。本文旨在探究乳酸对心肌成纤维细胞纤维化表型的调节作用和可能机制。

一、材料与方法

1 材料

动物SPF级C57BL/6小鼠，鼠龄0～3 d, 体质量1～2 g, 广东省医学科学院医学研究中心提供。动物生产许可证号：SCKK(粤)2013-0034。本实验经广东省人民医院伦理委员会批准(伦理批号：KY-N-2022-066-01)。

试剂L-乳酸，规格：每瓶100 mg, 批号：79-33-4,购自美国Sigma-Aldrich公司；TGF-β1蛋白，规格：每支100 μg, 纯度：>95%,批号：10804-H08H-B,购自美国Sino Biological公司；乳酸转运蛋白(monocarboxylate transporters, MCTs)抑制药(CHC),规格：每支100 mg, 纯度：>95%,批号：28166-41-8,购自美国Bio-Techne公司。胎牛血清、DMEM/F12细胞培养基、胰蛋白酶-EDTA、蛋白浓度检测试剂盒，均购自美国Thermo Fisher公司；蛋白裂解液，购自上海碧云天公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体、Ⅰ型胶原A1(collagen type Ⅰ alpha 1,COL1A1)抗体，均购自美国Proteintech公司；α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、COL3A1抗体，均购自英国Abcam公司；Pan Kla抗体、H3K18la抗体，均购自景杰生物公司；H3抗体，购自美国CST公司；ECL化学发光检测试剂盒，购自天涯生物公司。

仪器Multiskan GO酶标仪，美国ThermoFisher Scientific公司产品；LAS 500一体化成像仪，美国Sievers公司产品；TS100倒置荧光显微镜，日本尼康公司产品。

2 实验方法

2.1 细胞分离与培养

将日龄为0～3 d的C57BL/6小鼠在生物安全柜中用75%乙醇进行消毒后，用高压灭菌后的医用眼科剪沿小鼠胸腔横向剪开并用弯头镊子小心取出心脏。新鲜取出的小鼠心脏浸泡在磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)中并进行血管修剪后置于胰蛋白酶-0.25% EDTA -PBS中，于4 ℃摇床中消化16～18 h。反复吹打至瓶壁内无细胞残留后离心，用含10%胎牛血清F12培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液均匀接种到细胞培养瓶培养1 h, 更换培养液稳定培养至P2代后进行后续相关实验处理。

2.2 模型构建、细胞分组与给药方法

用10 ng·mL TGF-β1刺激P2代小鼠心肌成纤维细胞建立成纤维细胞纤维化模型[5]。

将小鼠心肌成纤维细胞分为对照组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组、TGF-β1组、联合组和CHC组。对照组细胞给予常规培养，低剂量实验组细胞给予4 mmol·L-1L-乳酸处理24 h, 中剂量实验组细胞给予8 mmol·L-1L-乳酸处理24 h, 高剂量实验组细胞给予12 mmol·L-1L-乳酸处理24 h, TGF-β1组细胞给予10 ng·mL-1TGF-β1处理24 h, 联合组细胞给予10 ng·mL-1TGF-β1和12 mmol·L-1L-乳酸处理24 h, CHC组给予3 mmol·L-1CHC处理24 h。

2.3 划痕实验检测细胞的迁移能力[6]

在6孔细胞板中接种P2代小鼠心肌成纤维细胞，在细胞融合度达75%时，感染绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)腺病毒，待细胞表达GFP荧光且细胞融合达85%以上时，用与孔板相匹配的枪头进行直线划痕，用PBS清洗后，按分组加入不同药物，用荧光倒置显微镜观察(记为0 h),培养24 h后在0 h同一位置拍照(记为24 h)。用Image J分析并计算细胞迁移率。

2.4 蛋白质印迹法检测细胞纤维化相关蛋白表达以及泛乳酸化表达情况[7]

将药物处理20 h后的细胞进行裂解后，在4 ℃下，以1.0×104r·min-1离心13 min后吸取上清液并完成蛋白浓度测定。取蛋白12 μg后加入4×loading置于99 ℃的聚合酶链反应仪中变性。蛋白上样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE),转膜，5%脱脂牛奶封闭，相应的蛋白条带分别用相应的一抗抗体[COL1A1(1∶1 000)、COL3A1(1∶1 000)、α-SMA(1∶2 500)、GAPDH(1∶5 000)、PanKla(1∶1 000)、H3K18la(1∶1 000)、H3(1∶1 000)]置于4 ℃摇床孵育18 h, 用对应二抗于4 ℃冰箱孵育18 h, 最后发光显影。用Image J软件对各目的条带的灰度值做分析处理。

3 统计学处理

用Image J和GraphPad 9.0软件分析图片，用SPSS 24.0软件进行统计分析。计量资料以

表示，组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1 L-乳酸抑制小鼠心肌成纤维细胞中纤维化相关蛋白表达

对照组给予常规培养；低、中、高剂量实验组分别给予4、8、12 mmol·L-1L-乳酸；TGF-β1组给予10 ng·mL-1TGF-β1;联合组给予10 ng·mL-1TGF-β1+12 mmol·L-1L-乳酸；CHC组给予3 mmol·L-1CHC。

中、高剂量实验组的COL1A1、COL3A1和α-SMA蛋白相对表达水平均较对照组显著下降，在统计学上差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.001),见表1。

2 L-乳酸抑制TGF-β1诱导小鼠心肌成纤维细胞增殖和纤维化相关蛋白表达

对照组、TGF-β1组、高剂量实验组和联合组的细胞迁移率分别为(40.56±0.03)%、(61.61±0.04)%、(26.59±0.05)%和(38.33±0.06)%;TGF-β1组、高剂量实验组的细胞迁移率和对照组比较，TGF-β1组的细胞迁移率和联合组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.01),见图1。

表1各组小鼠心肌成纤维细胞纤维化相关基因蛋白相对表达水平的比较

图1L-乳酸对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导小鼠心肌成纤维细胞迁移的影响(×100)

表2TGF-β1和L-乳酸处理小鼠心肌成纤维细胞后细胞中纤维化相关基因蛋白相对表达水平的比较

Compared with control group,**P<0.01,***P<0.001; Compared with TGF-β1 group,###P<0.001.

TGF-β1组与对照组相比，COL1A1、COL3A1和α-SMA蛋白相对表达水平均显著增加，而联合组与TGF-β1组相比，COL1A1、COL3A1和α-SMA蛋白相对表达水平均显著下降，在统计学上差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.001)。结果见表2。

3 L-乳酸和CHC抑制药对小鼠心肌成纤维细胞迁移和纤维化相关蛋白表达的影响

对照组、高剂量实验组和CHC组的细胞迁移率分别为(62.60±6.50)%、(28.00±8.15)%和(39.40±4.50)%,高剂量实验组、CHC组的细胞迁移率与对照组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.001),见图2。

高剂量实验组和CHC组的小鼠心肌成纤维细胞内 COL1A1、COL3A1和α-SMA蛋白相对表达水平均较对照组均显著降低，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.01),见表3。对照组、高剂量实验组和CHC组的Pan Kla修饰水平分别为1.06±0.07,1.54±0.09和1.53±0.12,H3K18la蛋白修饰水平分别为0.67±0.06,1.23±0.06和1.14±0.08,高剂量实验组和CHC组的小鼠心肌成纤维细胞蛋白的泛乳酸化修饰(Pan Kla)水平和H3K18la水平(P<0.05,P<0.001)均较对照组显著增加，见图3。

图2L-乳酸和乳酸转运蛋白抑制药(CHC)对小鼠心肌成纤维细胞迁移的影响 (×100)

表3CHC和L-乳酸处理小鼠心肌成纤维细胞后细胞中纤维化相关基因蛋白表达水平

图3L-乳酸和CHC增加小鼠心肌成纤维细胞蛋白乳酸化修饰

三、讨论

MF是心脏修复及适应病理刺激的反应过程，大量心肌成纤维细胞在多种病理条件作用下激活心肌成纤维细胞，进而会导致细胞外基质(extracellular matrix, ECM)蛋白的过度堆积[8]。虽然成纤维细胞样细胞亚群可能在修复性和间质/血管周围纤维化中发挥重要的保护作用，但是ECM的产生和降解长时间处于动态失衡状态，最终会扰乱心脏正常的收缩、舒张和心电传导功能。

乳酸是心脏的重要能量来源，在心脏生理情况下，脂肪酸氧化是产生腺苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)的主要能量来源，而在心肌损伤的情况下，心肌细胞会转向不依赖丙酮酸氧化的糖酵解代谢[9-12]。研究表明，单羧酸转运蛋白4(monocarboxylate transporter 4, MCT4)活性被抑制会使得心肌细胞的乳酸外排减少，进而有效缓解心力衰竭，提示乳酸对心肌细胞起到保护作用[12]。本研究结果显示，L-乳酸可以抑制传代培养的小鼠心肌成纤维细胞和TGF-β1诱导小鼠心肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达和细胞迁移能力，在细胞水平证实乳酸具有抑制MF的作用，与以往报道[13]的结论相符。

乳酸可以转化为乳酰辅酶A,参与组蛋白和非组蛋白的乳酸化修饰[14]。乳酸化修饰是蛋白质翻译后的一种修饰类型，基因启动子区组蛋白发生乳酸化修饰，可以促进或抑制这些基因的转录，而乳酸化修饰也可以直接调节蛋白的生物活性[15]。研究显示，当心肌损伤时，心脏组织中的乳酸明显减少，给予乳酸钠或抑制乳酸外流可以通过恢复心肌肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain, α-MHC) K1897的乳酸化和α-MHC-titin的相互作用，进而起到缓解心力衰竭的作用[16]。

MCTs广泛分布在各组织细胞膜上，其中MCT1、MCT4起着乳酸在细胞间穿梭，维持着不同细胞中乳酸稳态的作用[17]。MCT1负责将细胞质中的乳酸转运进细胞内进一步氧化，而MCT4主要在高糖酵解细胞中表达，促进胞内乳酸输出。本研究用MCT抑制药使得胞内和胞外乳酸转运失效，结果显示，经CHC和L-乳酸处理均可以显著抑制小鼠心肌成纤维细胞中纤维化相关蛋白COL1A1、COL3A1和α-SMA表达和细胞迁移能力，同时能显著升高细胞蛋白Pan Kla和组蛋白H3K18la修饰水平。以上结果提示，L-乳酸发挥抑制小鼠心肌成纤维细胞纤维化表型的作用与提高细胞内乳酸水平，升高Pan Kla和H3K18la修饰水平有关。

本研究提示，L-乳酸可以通过提高Pan Kla和H3K18la修饰水平来发挥抑制小鼠心肌成纤维细胞纤维化表型的作用。在后续的研究中，本课题组将在细胞和整体水平实验进一步明确L-乳酸发挥抑制MF的分子机制。

参考文献:

[5]莫晓彤,张彤,唐其柱.高丽槐素对TGFβ诱导的大鼠心脏成纤维细胞增殖和活化的抑制作用及机制[J].武汉大学学报(医学版),2024,45(9):1017—1022.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(82070254);广东省自然科学基金资助项目(2023A1515010201,2022A1515012522,2022A1515012175);

文章来源:陈凯茵,欧涛,李艺,等.乳酸抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的研究[J].中国临床药理学杂志,2024,40(21):3102-3107.