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阿苯达唑对人食管鳞癌细胞KYSE-150的抑制作用

2024-07-10 119 上传者：管理员

摘要：目的研究阿苯达唑对食管鳞癌KYSE-150细胞的抑制效果及作用机制。方法通过MTT法和克隆形成实验评估KYSE-150细胞的增殖能力，利用划痕和Transwell小室实验证明细胞的迁移和侵袭能力。同时，采用凋亡与坏死检测试剂盒检测阿苯达唑是否能够诱导KYSE-150细胞凋亡，并利用Western blot实验探讨凋亡相关蛋白BAX、Bcl-2、P53的表达水平。结果阿苯达唑能够以剂量依赖性的方式抑制KYSE-150细胞的活力、增殖、迁移和侵袭能力。YO-PRO-1/PI双染检测结果表明，阿苯达唑能够诱导细胞凋亡，同时使Bcl-2蛋白表达下调，而BAX、P53蛋白表达上调。结论阿苯达唑对食管鳞癌KYSE-150细胞的增殖与迁移具有显著抑制作用，其机制可能与对凋亡相关蛋白的调控有关。

关键词：
凋亡
恶性肿瘤
迁移
阿苯达唑
食管鳞癌
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食管癌作为一种常见的恶性肿瘤，属于消化系统疾病。据统计，食管癌在全球癌症中的发病率排名第八，死亡率排名第六，每年约有30万人死于食管癌[1]。食管癌的病理类型主要分为鳞癌与腺癌，而我国最常见的是鳞癌。目前，食管鳞癌的主要治疗方式包括手术切除、放疗和化疗。然而，食管鳞癌有着浸润性生长的特点，患者常常会出现对长期化疗和放疗药物的耐药性。同时，一些患者由于体质较差而难以忍耐放化疗带来的不良反应与毒副作用。因此，食管鳞癌的预后通常较差，患者的生存时间较短。

阿苯达唑(albendazole)是一种抗寄生虫药物，已获得美国食品药品监督管理局批准，具有良好疗效和低毒性，在肠道内吸收缓慢，具有一定的脂溶性并能穿过血脑屏障。本研究旨在探讨阿苯达唑是否对食管鳞癌细胞具有抑制作用，并初步研究其作用机制。

1、材料与方法

1.1 材料来源

阿苯达唑购买自上海源叶生物科技有限公司。RPMI-1640培养基和胎牛血清均购自Gibco公司，人食管鳞癌细胞KYSE-150实验室自行保存。YO-PRO-1/PI凋亡检测试剂盒购自碧云天，GAPDH抗体购自Beyotime生物公司，而Bax、P53、Bcl-2 抗体购自ABclonal公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将细胞从液氮中取出，在37℃水浴锅中解冻复苏，并放置于37℃、5% CO2培养箱中。完全培养基含有1640基础培养基、双抗(青霉素、链霉素)以及胎牛血清混合液。待细胞长满后，进行传代保种操作：首先用PBS洗涤细胞2次，然后胰酶进行消化1min, 待细胞变圆后，加入细胞培养基终止消化，将混合物放入离心机中以800rpm的速度离心5min; 弃掉上清液，加入1mL培养液轻轻吹打，将细胞悬液移至含有4mL细胞培养基的细胞培养瓶，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中。一旦细胞状态良好，即可进行后续实验，实验重复3次。

1.2.2 MTT法实验

当食管鳞癌KYSE-150细胞处于对数生长期时，进行以下步骤：用PBS洗涤细胞两次，然后加入1mL胰酶消化1min。待细胞形态变圆后，加入1mL细胞培养液终止消化，并将细胞悬液吸取至离心管中离心5min, 倒掉上清液。调整细胞浓度至每孔12 000个细胞，96孔板最外一圈孔中加入100μL PBS,其余每个孔中加入100μL细胞悬液。随后将96孔板放入细胞培养箱中静置24h, 待细胞贴壁后更换含不同浓度(0、1、2、4、8、16μmol/L)的阿苯达唑培养液100μL/每个孔，每组设6个复孔。继续放培养箱培养24h后取出，避光下每个孔中加入10μL MTT,包裹锡纸后在培养箱中孵育4h取出，每个孔加入150μL DMSO溶液进行震荡混合10min。最后使用酶标仪以490nm波长检测吸光度值。

细胞存活率=(药物组吸光度值/对照组吸光度值)×100%。

1.2.3 平板克隆形成实验

将生长对数期的KYSE-150细胞进行消化和离心、计数，将细胞密度调整至每孔5000个细胞，每孔加入2mL完全培养基，放入培养箱中培养24h。当细胞贴壁后，去除培养液，用PBS溶液洗涤1～2次。每孔给予3mL不同浓度(0、0.25、0.5、1、2、4μmol/L)的阿苯达唑培养液，连续处理7d。肉眼可见到克隆后，丢弃含有药物的培养液，用PBS清洗3次。用4°甲醛固定细胞30min, 结晶紫染色，洗净晾干，最后进行拍照并计数。

1.2.4 细胞划痕实验

处于生长对数期的KYSE-150细胞调整密度至每孔30万个，接种在6孔板中。等细胞贴壁长满后进行划痕实验，用枪头划出划痕，使用PBS清洗去除划痕处的细胞，随后加入含有不同浓度(0、1、2、4、8、16μmol/L)的阿苯达唑培养基培养24h。在实验的0、24h时进行拍照。

1.2.5 Transwell迁移实验

将细胞浓度调整至1×104/mL,含阿苯达唑的浓度梯度设置为0、2、4、8μmol/L作为实验组，而仅添加培养基的为对照组。将500μL含有20%血清的培养基加入下室(同时含0、2、4、8μmol/L阿苯达唑溶液),在上室内加入200μL的细胞悬液，放入培养箱中培养24h。第2天取出上室，用PBS清洗2次，用甲醇溶液固定20～30min, 之后弃掉固定液，用PBS洗涤一次，使用0.1%结晶紫染色20min, 轻轻擦干后进行拍照和计数。

1.2.6 Transwell 侵袭实验

调整细胞浓度为1×104/mL,预先将基质胶从4℃冰箱取出解冻，按比例将其注入小室底部，放入培养箱中烘30min。与迁移实验一样，下室中加入500μL含20% FBS的培养基，药物浓度分别为0、2、4、8μmol/L,然后用镊子将Transwell小室放置于24孔板内(注意：下层培养液和小室之间不应有气泡),在基质胶上方加入200μL细胞悬液后放入培养箱。24h后取出，用PBS洗涤两次，甲醇中固定20～30min, 弃掉固定液，用0.1%结晶紫染色20min, 轻轻擦掉结晶紫，在干燥后选取适当的视野进行拍照和计数。

1.2.7 YO-PRO-1/PI细胞染色

在24孔板中接种KYSE-150细胞，每孔含10万个细胞，加入含有阿苯达唑(0、2、4、8μmol/L)的1640培养基培养24h。根据说明书的比例进行染色，将板置于37°避光条件下孵育30min。倒置荧光显微镜下观察并进行计数，拍摄照片。红色荧光代表PI染色阳性细胞，绿色荧光代表YO-PRO-1染色阳性细胞。

1.2.8 蛋白检测

在不同浓度梯度(0、2、4、8μmol/L)阿苯达唑孵育细胞24h后，使用PBS清洗去除漂浮细胞，并利用滤纸吸干水分。加入适量的RIPA裂解液裂解细胞20min, 使用细胞刮刀将细胞粘液刮下并收集到1.5mL离心管中，在4℃下以15 000rpm的速度离心15min, 收集上清液，即为总蛋白溶液。随后按照Western blot实验步骤进行操作，包括蛋白上样、电泳、转膜、封闭、一抗孵育过夜，二抗孵育1h, 随后进行显影。使用Image J软件进行分析，计算Bax、Bcl-2、P53的灰度值与GAPDH的灰度值之比，以确定其相对表达量。

1.3 统计学方法

数据分析和绘图将使用GraphPad Prism 9.0软件进行。采用One-Way ANOVA进行统计数据分析，当P<0.05时表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 阿苯达唑抑制人食管鳞癌KYSE-150细胞的增殖

通过MTT实验检测食管鳞癌细胞的活力情况，结果如图1。在显微镜下观察不同浓度的阿苯达唑作用于细胞后，KYSE-150细胞的活力明显下降，与空白对照组相比有显著差异(P<0.05),表明阿苯达唑可以有效抑制KYSE-150细胞的增殖，且该抑制作用随着药物浓度呈现出一定的依赖性。

图1 阿苯达唑对KYSE-150细胞增殖的影响

2.2 阿苯达唑抑制人食管鳞癌KYSE-150细胞克隆形成

在平板克隆实验中观察到，随着阿苯达唑给药浓度的增加，细胞集落的数量逐渐减少(P<0.05),见图2。这表明，阿苯达唑对KYSE-150细胞的克隆集落形成具有显著的抑制作用，并随着药物浓度的增加而增强(P<0.05)。

图2 阿苯达唑对KYSE-150细胞克隆形成的影响

2.3 阿苯达唑抑制人食管鳞癌KYSE-150细胞横向迁移

划痕实验结果表明，经过不同浓度的阿苯达唑处理后，细胞在24h内的迁移能力明显低于对照组，且呈现出剂量依赖性。见图3。与对照组相比，实验组的划痕宽度随着药物浓度的增加逐渐扩大，且实验组的细胞迁移率下降幅度在统计上显示出明显的差异(P<0.05)。

图3 阿苯达唑对KYSE-150细胞横向迁移的影响

2.4 阿苯达唑抑制人食管鳞癌KYSE-150细胞纵向迁移

与空白对照组相比，随着阿苯达唑给药浓度的增加，细胞的迁移数量显著减少(P<0.05),这表明阿苯达唑抑制了KYSE-150细胞的纵向迁移，并且这种抑制效果呈现出浓度依赖性。见图4。

图4 阿苯达唑对KYSE-150细胞纵向迁移的影响

2.5 阿苯达唑抑制人食管鳞癌KYSE-150细胞横向侵袭

与空白对照组相比，随着阿苯达唑给药浓度的增加，细胞的侵袭率显著降低(P<0.05),表明阿苯达唑能够抑制KYSE-150细胞的侵袭能力，并且这种抑制效果呈现出明显的浓度依赖性。见图5。

图5 阿苯达唑对KYSE-150细胞侵袭的影响

2.6 阿苯达唑诱导KYSE-150细胞凋亡

通过使用YO-PRO-1/PI染色法观察给药后细胞的凋亡情况。在相同曝光强度下，PI标记的红色荧光和YO-PRO-1标记的绿色荧光的细胞数量逐渐增加。与对照组相比，随着阿苯达唑浓度的增加，阿苯达唑诱导食管鳞癌细胞凋亡的水平上升，如图6所示。

图6 阿苯达唑对KYSE-150细胞凋亡的影响

2.7 Western blot实验检测肿瘤细胞Bax、Bcl-2、P53蛋白表达

不同浓度的阿苯达唑处理KYSE-150细胞24h后，Western blot检测结果显示Bcl-2的表达下调，而Bax和P53的表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图7。

图7 阿苯达唑对KYSE150细胞Bax、Bcl-2、P53蛋白表达的影响

3、讨论

根据2020年国家癌症中心的统计数据显示，食管鳞癌的发病率和死亡率在全国排名前五[2]。吸烟和饮酒是主要危险因素，化疗和放疗导致的耐药性和不良反应使治疗效果不佳。患者在早期往往没有明显的症状，而等到症状严重时已属晚期诊断。目前，中国治疗肿瘤的主要方式是手术切除为主，辅以放疗和化疗，但长期效果并不理想[3,4]。研究显示，中国食管鳞癌患者的5年生存率为20%[5]。鉴此，为开发安全性高、副作用小的药物用于治疗食管鳞癌患者以提高生存质量变得尤为重要。

阿苯达唑又称肠虫清，是一种抗寄生虫化合物，已在临床上使用了相当长的时间。该化合物能够破坏微管的形成，是一种广谱的苯并咪唑氨基甲酸酯类驱虫剂，具有较低的毒性，并被广泛用于人类和动物身上。阿苯达唑通过与β-微管蛋白结合并阻止微管的聚合，从而抑制寄生虫细胞的增殖。因此，它降低了寄生虫的存活和繁殖率。近年来，阿苯达唑也被用于癌症研究。阿苯达唑对肿瘤具有广泛的影响，包括抑制肿瘤生长、抑制增殖、阻滞细胞周期和促进细胞凋亡[6,7,8]。Kim等[9]的研究表明，阿苯达唑降低了蛋白β1和转录因子4的mRNA表达，并调节了Wnt/β-catenin信号通路及其相关的Twist家族BHLH转录因子1和Bcl-2等靶点。阿苯达唑相关的氧化应激基因和Wnt/β-catenin信号蛋白表达的降低被认为与ROS的产生有关。Petersen等[10]研究发现，阿苯达唑对结直肠癌细胞的活性通过激活caspase-3、磷脂酰丝氨酸的暴露、DNA片段化、线粒体膜通透性和ROS产生等途径，促使细胞周期停滞在G2/M期，破坏微管蛋白聚合。

本研究观察到，在24h内以梯度浓度给予阿苯达唑作用于KYSE-150细胞后，与对照组相比，当给药浓度达到8μmol/L时，在显微镜下看细胞体积缩小且变圆；而当给药浓度增至16μmol/L及以上时，活细胞数量逐渐减少，表明阿苯达唑对KYSE-150细胞增殖的抑制具有浓度依赖性。在细胞凋亡试剂盒染色后的24h内，YO-PRO-1标记出绿色荧光的凋亡细胞，而PI标记的细胞则显示红色荧光。随着给药浓度的增加，凋亡和坏死细胞的数量逐渐增多，这表明阿苯达唑诱导KYSE-150细胞凋亡的效果与药物浓度相关。综上所述，研究结果表明阿苯达唑能有效抑制KYSE-150细胞的增殖和迁移，并诱导细胞凋亡。

细胞凋亡是一种常见的程序性细胞死亡方式[11],在维持组织稳态中发挥重要作用。然而，一旦信号通路发生变化，可能导致细胞凋亡失调，从而促进肿瘤的发生。细胞凋亡可以通过内源性和外源性途径，包括线粒体途径等多种方式展开。在内源性途径中，P53、Bcl-2和Bax蛋白是研究最为深入的效应器。P53通过与Bcl-2家族蛋白相互作用，参与调控内源性凋亡途径。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡过程中起着关键作用，其中，Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，而Bax则是促凋亡蛋白，作为P53的下游信号，可被P53转录来抑制Bcl-2的活性，从而引发细胞的死亡。P53在调节细胞凋亡、细胞周期阻滞、衰老、DNA修复以及遗传稳定性方面发挥着主要调控作用，是细胞对多种刺激作出反应的重要协调者。

综上所述，体外实验结果显示，阿苯达唑能有效抑制KYSE-150的增殖和迁移，并通过上调Bax、P53以及下调Bcl-2蛋白表达来促进癌细胞的凋亡。然而，本研究仅完成了对体外实验的初步研究，后续计划进行动物实验，以验证阿苯达唑在动物体内是否具有类似的作用，从而为临床治疗食管鳞癌提供更为有效的手段。

参考文献:

[2]刘宗超,李哲轩,张阳,等.2020全球癌症统计报告解读[J].肿瘤综合治疗电子杂志,2021,7(2):1

[6]刘胜莉,章斌.阿苯达唑抗肿瘤作用机制的研究进展[J].现代药物与临床,2019,34(6):1927

文章来源:蔡敬,贾爱亭,曾凤娇,等.阿苯达唑对人食管鳞癌细胞KYSE-150的抑制作用[J].湖北科技学院学报(医学版),2024,38(04):287-291+296.