烟雾诱导的炎性氧化应激、细胞凋亡和细胞衰老对促进慢性阻塞性肺疾病(COPD)上皮细胞损伤进而介导肺气肿进展和严重肺功能下降显著作用。有研究表明，自噬在调节COPD发病机制中具有重要作用[1],香烟/尼古丁暴露会引起自噬损伤。香烟是引发COPD的主要原因之一。研究显示，香烟烟雾提取物(CSE)在体外诱导人气道上皮细胞自噬[2]。气管和肺泡内上皮细胞是吸入性香烟烟雾(CS)的主要目标。长链非编码(lnc)RNA是一类不编码蛋白、长度超过200 nt的内源性RNA[3]。起初人们认为其不具有任何生物学功能，随着研究深入，发现lncRNA在表观遗传、转录调控、转录后调控及蛋白质代谢等方面发挥重要作用[4]。多项研究表明，lncRNA是细胞自噬的重要调控分子。H19是目前研究较多的一个lncRNA分子，其与胰岛素样生长因子(IGF)2在小鼠体内位于第7号染色体，在人体位于11p15.5,是第一对被证实为具有印记特性的基因[5]。

miRNAs是一类长度约为22 nt的内源性非编码单链RNA[6]。它作为一类非编码的小分子RNA,参与调控30%～50%基因的转录和表达[7],调节包括自噬在内的多种细胞途径，以miRNAs为靶点是一种新兴的癌症治疗策略。沉默调节蛋白(SIRT)1是一种广泛分布于细胞内和细胞外的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性组蛋白脱乙酰基酶[8]。SIRT1通过转录因子、组蛋白和协同激活因子[如核转录因子(NF)-κB p65]的去乙酰化来调节炎症、衰老、应激抵抗、衰老、凋亡/自噬和其他细胞功能[9]。本研究通过体外诱导COPD细胞模型，采用小干扰RNA(siRNA)干扰技术沉默lncRNA H19,检测lncRNA H19、miR-194-5p、SIRT1,电镜观察COPD上皮细胞超微结构及自噬体，并检测下游AMP激活蛋白激酶(AMPK)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路及自噬相关指标表达水平，旨在为防治COPD提供理论依据。

1、材料与方法

1.1实验材料

实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂盒(R223-01,Vazyme诺唯赞),Trizol总RNA抽提试剂(CW0580S)、miRNA cDNA逆转录试剂盒(CW2141S)、miRNA qPCR检测试剂盒(CW2142S)、miRNA纯化提取试剂盒(CW0627S),超纯RNA提取试剂盒(CW0581M,CWBIO康为世纪),2×SYBR Green PCR Master Mix(A4004M,Lifeint生命互联),荧光PCR仪[伯乐生命医学产品(上海)有限公司],完全DMEM(高糖)培养基(KGM12800S)、CCK8法细胞增殖检测试剂盒(KG150255,凯基生物),Opti-MEM(31985-070,Gibco),桑色素(PXHJB-ED,TCL),人气道上皮细胞(16HBE、293T,BNCC337733、BNCC102146,北纳生物),LipofectamineTM3000转染试剂(L3000015,InvitrogenTM),双荧光素酶报告基因检测试剂盒(RG027,碧云天),CO2培养箱(BPN-80CW,上海一恒科学仪器有限公司),倒置荧光显微镜(MF53,广州市明美光电有限公司),洁净工作台(BBS-SDC,BIOBASE),全自动酶标仪(WD-2102B,北京六一生物科技有限公司),多功能酶标仪(02L3006,TECAN),超高灵敏度化学发光成像系统(Chemi DocTM XRS+),透射电镜[JEM-1230(80 kV),JEOL]。

1.2 CSE制备及细胞造模

10 ml 16HBE细胞培养基置于50 ml离心管中，用橡胶塞密闭离心管，橡胶塞开两个孔，置一根长管穿过橡胶塞，插入液面以下，置一根短管插入穿过橡胶塞置于液面以上。点燃一支烟，启动抽气泵，匀速间歇抽气，约2 min燃尽。卸下抽气装置和橡胶塞，盖好离心管，密闭放置1 h后，过0.22μm滤膜，备用。将CSE用16HBE相应培养液稀释成2.5%的CSE,根据实验分组进行造模处理48 h。将桑色素用细胞相应培养液稀释成浓度为5、10、20、40、80 nmol/L的含桑色素培养液，根据实验分组进行加药处理24、48 h。

1.3荧光素酶检测

细胞密度达到50%进行转染，提前换成含5%血清的培养基。实验准备12孔板的293T共39个孔。转染48 h后收集各组细胞，每孔加入200μl裂解液，4℃裂解20 min,将裂解后的细胞样品。每组取细胞裂解液70μl,加入黑色96孔板中，加入荧光素酶检测试剂每孔100μl,上机检测萤火虫荧光素酶活性；再向各孔中加入100μl海肾荧光素酶检测试剂(检测底物∶缓冲液=1∶100),上机检测海肾荧光素酶活性。

1.4细胞转染及细胞分组

①当细胞密度达70%时，准备转染；②更换培养基为无血清的培养基，体积为1 ml;③取灭菌的EP管2个，每管加125μl Opti-MEM,其中一管加入5μl Lipofectamine3000,另一个EP管加入2.5μg质粒和5μl P3000混匀，室温静置5 min;④将步骤③中两个EP管内的溶液混匀，室温静置15 min,将混合液滴到6孔板中对应的孔内，将细胞放回孵箱培养；⑤转染4 h后在6孔板中加入血清含量为20%的完全培养基1 ml; 48 h后进行相应检测。实验分为：空白对照(Control)组、细胞+2.5% CSE处理(CSE)组、模型+ lncRNA H19干扰对照(lncRNA H19 NC组)组、模型+ lncRNA H19干扰(lncRNA H19-siRNA)组；细胞造模：根据实验分组将2.5%CSE培养液处理细胞48 h;利用RT-qPCR检测lncRNA H19、miR-194-5p、SIRT1 mRNA表达水平和Western印迹检测SIRT1、mTOR、p-mTOR、微管相关蛋白1轻链(LC)3-Ⅱ/Ⅰ、自噬相关蛋白(Beclin)-1、自噬相关基因(ATG)7、p62蛋白表达。

1.5透射电镜

透射电镜生物样品制备2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2 h或更长时间。用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗15 min, 3次。1%锇酸固定液固定2～3 h,用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗15 min, 3次。50%乙醇脱水15～20 min, 70%乙醇脱水15～20 min, 90%乙醇脱水15～20 min, 90%乙醇和90%丙酮(1∶1)脱水15～20 min, 90%丙酮脱水15～20 min。以上在4℃冰箱内进行。100%丙酮室温脱水15～20 min,共3次。包埋：纯丙酮+包埋液(2∶1)室温3～4 h,纯丙酮+包埋液(1∶2)室温过夜，纯包埋液(37℃)2～3 h。固化：37℃烘箱内过夜，45℃烘箱内12 h, 60℃烘箱内48 h。超薄切片机切片70 nm, 3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，闭透射电镜JEOL JEM-1230(80 kV)观察、拍片。

1.6 RT-qPCR检测

收集各组细胞样本，进行裂解，分别提取细胞中的RNA和miRNA,经浓度测定后，再通过逆转录得到cDNA,再用基因相应引物和荧光定量试剂盒上样进行相对表达量测定按照2-ΔΔCt法计算相对表达量。引物序列(5′-3′):miR-194-5p正向：CGCGTGTAACAGCAACTCCA,反向：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT;lncRNA H19正向：GC-GGGTCTGTTTCTTTACTTC,反向：TTCCGATGGTGT-CTTTGATG;SIRT1正向：TAGGCGGCTTGATGGTAATC,反向：CTGGCATGTCCCACTATCAC;β-actin正向：TGGCACCCAGCACAATGAA,反向：CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA;U6正向：CTCGCTTCGGCAGCACA,反向：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.7 Western印迹检测

收集各组细胞样本，加入裂解液后冰上放置20 min后，吸入一EP管中，12 000 r/min高速离心机离心10 min,取上清液移至新的EP管，应用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性，制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),上样进行SDS-PAGE 1.5 h,后用300 mA恒流转膜80 min。一抗溶液孵育，4℃过夜；二抗溶液中室温孵育2 h。洗膜，用发光液浸湿聚偏氟乙烯(PVDF)膜后放置于超高灵敏度化学发光成像系统运行程序显影成像。用ImageJ软件分析各蛋白条带灰度值。

1.8统计学分析

采用Graphpad Prism7软件进行方差分析。

2、结 果

2.1双荧光素酶验证lncRNA H19/miR-194-5p、miR-194-5p/SIRT1互作关系

如表1所示，野生型lncRNA H19-WT和miR-194-5p结合后，能够显著降低荧光素酶活性(P<0.05);而突变型lncRNA H19-MUT和miR-194-5p结合后对荧光素酶活性无显著变化(P>0.05),表明lncRNA H19和miR-194-5p存在靶向关系。同样，野生型SIRT1-WT与miR-194-5p结合后能够显著降低荧光素酶活性(P<0.05);而突变型SIRT1-MUT与miR-194-5p结合后对荧光素酶活性没有影响，表明miR-194-5p和SIRT1存在靶向关系。

表1 lncRNA H19/miR-194-5p、miR-194-5p/SIRT1的互作关系

2.2 lncRNA H19干扰载体构建及验证

与Control组(1.00±0.00)相比，siRNA NC组LncRNA H19表达(1.00±0.19)无明显变化(P>0.05);与siRNA NC组相比，两个干扰载体siRNA-1组及siRNA-2组LncRNA H19表达(0.01±0.00、0.01±0.00)明显下降(均P<0.05),提示两个干扰载体均有效，后续实验选定siRNA-2。

2.3透射电镜检测lncRNA H19干扰对CSE处理细胞自噬影响

如图1所示，与Control组相比，CSE组细胞自噬小体显著增加。与CSE组相比，lncRNA H19干扰后的细胞自噬小体显著下降。说明干扰lncRNA H19对细胞自噬起到抑制作用。

2.4 RT-qPCR检测各组CSE处理细胞中lncRNA H19、miR-194-5p、SIRT1mRNA表达

如表2所示，CSE处理后的lncRNA H19和SIRT1 mRNA表达升高，miR-194-5p mRNA表达下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。且干扰lncRNA H19后miR-194-5p mRNA表达上升，lncRNA H19和SIRT1表达下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明lncRNA H19对miR-194-5p起抑制作用。

图1 LncRNA H19干扰对CSE处理细胞自噬的影响

与Control组相比：1)P<0.05;与CSE组相比：2)P<0.05;表3同

表2各组lncRNA H19、miR-194-5p、SIRT1 mRNA表达

2.5 lncRNA H19对mTOR信号通路相关蛋白表达的影响

CSE处理细胞后ATG7、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ和SIRT1蛋白表达显著增加，p62和p-mTOR/mTOR蛋白表达明显下降(P<0.05)。干扰lncRNA H19后，ATG7、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ和SIRT1蛋白表达显著减少，p62和p-mTOR/mTOR蛋白表达明显增加(P<0.05)。见图2、表3。

图2 lncRNA H19对mTOR信号通路相关蛋白表达的影响

1～4:Control组、CSE组、lncRNA H19 NC组、lncRNA H19-siRNA组

表3各组SIRT1、mTOR、p-mTOR、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、ATG7、p62蛋白表达

3、讨 论

CS可增加自噬体转换(通量),并促进上皮细胞死亡，进而引发和夸大气道炎症和黏液分泌过多[10]。有报道称CS加速自噬反应，进而导致上皮细胞死亡。许多研究报道吸烟会损害上皮细胞自噬和有丝分裂，从而导致有缺陷的自噬复合物积累和细胞衰老[11]。有研究已经表明，虽然烟雾暴露确实会诱导气道上皮细胞中的自噬信号，但这是一种短暂反应，长时间暴露最终会抑制或损害上皮细胞自噬[12]。因此本研究利用CSE提取物对细胞进行造模。 研究发现，lncRNA H19异常表达可作为一种致癌因子或抑癌因子，在调节肿瘤的生长、转移和侵袭中发挥重要作用[13]。lncRNA H19在肺癌组织和细胞中均高表达，其过度表达促进细胞迁移、侵袭。通过负调节miRNA促进细胞上皮间充质转化[14]。生物信息学分析表明，miR-194-5p是miRNA其中一种，可以直接与H19结合，已在结肠癌中得到了证实[15]。多项研究表明，miRNA参与细胞自噬的调节[16]。SIRT1是miR-194-5p的直接靶点[15],结肠癌中其靶基因SIRT1表达升高，从而促进肿瘤细胞的自噬等[6]。本研究与上述结果一致，说明lncRNAH19/miR-194-5p/SIRT1参与COPD细胞自噬的调节。自噬是一个严格调控的过程，ATG是调节自噬的关键分子。其中ATG5和ATG7是自噬小体形成所必需的[17]。H19也参与了自噬的调控。H19对Beclin-1有正向调控作用，同时H19通过作用于ATG7参与了自噬体的延伸/闭合过程[18]。LC3B作为自噬的重要标志物，在自噬过程中，LC3Ⅰ转变为LC3Ⅱ从而与自噬体膜结合，是自噬体形成必不可少的一部分[19]。Beclin-1是一种自噬促进蛋白，通过调节自噬与溶酶体的融合而发挥作用[20]。作为一种自噬底物，p62是一种与LC3Ⅱ相互作用的支架蛋白，其作用主要是参与自噬内容物的降解[21]。本研究结果说明，lncRNA H19会通过结合miR-194-5p/SIRT1的作用从而参与调控COPD中的细胞自噬水平。mTOR信号通路是调控细胞自噬的关键通路，在细胞自噬中发挥着重要作用。H19又可以促进自噬，具体机制可能与mTOR信号通路有关[22]。mTOR1对自噬起着主要的调控作用[23～25]。当细胞受到饥饿、营养缺乏时，mTOR1活性被抑制，自噬活性增加[26]。通过细胞实验干扰H19可以促进由CSE处理后mTOR的磷酸化，从而可以抑制细胞自噬的发生。综上，CSE诱导人气道上皮细胞自噬，进而导致上皮细胞死亡，驱动COPD的发病过程，而H19表达降低，促使miR-194-5p表达量升高及其靶基因SIRT1表达量下降，进而使AMPK-mTOR信号通路减弱，调节自噬，减少上皮细胞的凋亡，从而治疗COPD。

基金资助:国家自然科学基金(81960892);

文章来源:刘震,曾扬,李蕊,等.lncRNA H19/miR-194-5p/SIRT1信号轴对细胞自噬的调控作用[J].中国老年学杂志,2024,44(17):4171-4176.