近年来，随着人们生活水平的日益提高，对肉、蛋、奶及皮毛等畜牧产品的需求量也越来越大。截至2021年，我国畜牧业总产值已经达到4万亿元，相较于2010年翻了一倍，全国牛存栏量已经达到9 817.2万头[1]。牛为大型的哺乳动物，在所有的规模化养殖场中牛的粪便排放量最大，一头成年牛的日均粪便排放量是鸡的75倍，是猪的6倍[2],因此不及时采取相应措施就会产生不可逆转的生态环境污染。

在自动化、机械化飞速发展的今天，畜牧业的集约化、规模化养殖程度也越来越高，养殖过程中产生的粪便等废弃物越来越集中，对环境造成的影响也更严重[3]。据估算，全国每年产生的畜禽粪污约38亿t, 综合利用率不到60%[4],污染情况十分严峻，粪污资源化利用的技术需要提高，措施需要进一步完善。《农业农村污染治理攻坚战行动方案(2021—2025年)》指出，要加强养殖业污染防治，具体措施包括推行畜禽粪污资源化利用、加强畜禽养殖污染防治监管等。

目前，主流的畜禽粪污资源化利用技术包括肥料化、垫料养殖、能源化及饲料化[5]。从实际情况来看，现在解决粪污的方法是以肥料化和沼气化为主，但是目前沼气发电的电能转化率只有35%,热能的转化率只有45%[6];同时沼气化过程比较复杂，对器械和操作人员都有较高的要求，初期的巨额投资和昂贵的设备维护费用使得沼气化技术难以全面推广[7]。好氧堆肥作为一种可持续的、生态友好的畜禽废弃物处理方法，是一种由微生物种群自加热和废弃物生物降解过程驱动的动态生物过程[8],具有产热量大、降解速度快、产生异味少、腐熟程度高、管理方便等优点，是目前使用最广泛的畜禽粪便处理方法。与其他畜禽粪便相比，牛粪具有含水率低、质地细密等特点，且含有丰富的有机质，更适合在好氧堆肥后作为有机肥还田利用[3]。但是传统好氧堆肥存在发酵时间长、温室气体排放量大、养分损失严重等问题，堆肥材料中高水平的木质素组分会延缓有机质的生物降解和生物转化，也限制了腐殖质的形成。合理使用外源微生物类添加剂不仅可以在一定程度上解决这些问题，而且还可以有效地提高堆肥产物的各项参数和废物的降解率[9-10]。

芽孢杆菌是一类生物多样性广、功能全面、抗逆性强的微生物群体，目前该类杆菌制剂已经在养殖替抗、环境污染治理和畜禽疫病防控等领域被广泛应用[11]。相关研究结果表明：枯草芽孢杆菌具有较强的产胞外蛋白酶的能力，又有较强的耐受金属离子的能力[12-13];对纤维素及木质素都具有明显的降解作用，且可以承受80 ℃高温，并在60 ℃条件下良好生长[14];能够显著抑制好氧堆肥温度的降低和成熟阶段的矿化，促进碳的腐殖化，提高堆肥中腐殖酸含量和堆肥产品品质[15]。因此，在牛粪好氧堆肥中选用枯草芽孢杆菌菌剂作为微生物添加剂具有很大的市场潜力。

本研究以枯草芽孢杆菌作为微生物添加剂接种肉牛粪进行堆肥，探究微生物添加剂对以牛粪为主要原料的好氧堆肥过程的影响，测定了堆肥温度、含水量、pH值、有机碳、全氮、碳氮比(C/N)、全磷、全钾、硝态氮、铵态氮、粗纤维及微生物含量等指标，以期揭示自然条件下接种枯草芽孢杆菌微生物添加剂的可行性，同时明确枯草芽孢杆菌的发酵堆肥效果。

1、材料

1.1 牛粪

堆肥用肉牛粪，采自宁夏回族自治区银川市某规模化肉牛养殖场。

1.2 菌种

枯草芽孢杆菌CGMCC1.15792,菌种含量为1×1010cfu/mL,由吉林农业大学高云航教授馈赠。

1.3 主要试剂

硝态氮标准品，购自武汉睿辰标物科技有限公司；硫酸，购自国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钾，购自广东翁江化学试剂有限公司；重铬酸钾，购自茂名市雄大化工有限公司；氯化钠、硫酸亚铁、葡萄糖，均购自上海广诺化学科技有限公司；氢氧化钠、乙醇，均购自天津市大茂化学试剂厂；过氧化氢，购自上海秦巴化工有限公司；硼酸，购自山西同杰化学试剂有限公司；伊红美蓝琼脂、脑心浸出液肉汤、豆粉琼脂，均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.4 主要仪器

烘箱(型号为DGX-9143BC-1),购自上海福马实验设备有限公司；紫外分光光度计(型号为721G),购自上海仪电分析仪器有限公司；Titrette滴定仪(型号为4760151),购自普兰德(上海)贸易有限公司；连续流动分析仪(型号为AA3),购自水尔分析仪器(上海)有限公司；光学显微镜(型号为NE910),购自深圳市博视达光学仪器有限公司；数显恒温水浴锅(型号为HH-6),购自常州国华电器有限公司；洁净工作台(型号为SW-CJ-2FD);购自苏州安泰空气技术有限公司；重复性温度记录仪(型号为GSP-6);购自江苏省精创电气股份有限公司；pH计(型号为PHS-25);购自上海雷磁科学仪器有限公司 。

2、方法

2.1 堆肥场建设

堆肥池设置在通风良好且遮蔽雨水的场地，堆肥池深10 cm, 周边设置高度为10 cm的土墙，堆肥池底部和土墙铺0.5 cm厚的塑料防渗黑膜，防渗黑膜上铺5 cm厚的碎土。堆肥场面积为4 m2,堆肥场的长和宽均为2 m, 可处理约4 t粪污。

2.2 堆肥发酵

清理圈舍粪污前1～2 d, 按照每个重复组牛粪使用量1 t, 用牛舍垫料调节牛粪水分含量为50%～60%。腐熟后的粪污堆成底宽为1.5～1.8 m, 上宽为0.6～0.8 m, 高为1.2～1.5 m的梯形条垛，按照0.1%的接种量接种枯草芽孢杆菌菌剂[16]。设置3个堆肥重复组，发酵过程采用简易静态好氧发酵，堆肥时间为40 d。

2.3 取样

在第0,5,10,15,20,25,30,35,40天分别采集发酵肉牛粪上1/3(上层)、中1/2(中层)和下1/3(下层)处堆肥样品1次。堆肥样品分为两份，一份在4 ℃条件下保存，用于测定pH值及水分、有机碳、总磷含量等理化指标；另一份按照每100 g堆肥加入10%酒石酸进行固氮，用于总氮、铵态氮、硝态氮含量等指标的测定。

2.4 温度的测定

使用重复性温度记录仪测量发酵肉牛粪上1/3(上层)、中1/2(中层)、下1/3(下层)处和环境温度，每天测量1次，连续监测40 d。

2.5 pH值和水分含量的测定

取4 ℃条件下保存的堆肥样品10 g与去离子水按照固液比为1∶10在120 r/min摇床上振荡浸提1 h, 4 000 r/min离心10 min后得到堆肥水浸提液，用pH计测定pH值并记录。取4 ℃条件下保存的堆肥样品50 g放入烧杯中，105 ℃烘干至恒重，用烘干前重量减去烘干后重量，即为水分含量。

2.6 有机物和微生物的测定

采用重铬酸钾氧化-分光光度法测定有机碳含量；采用凯氏定氮法测定全氮含量；用得到的有机碳和全氮含量计算碳氮比；采用奈氏比色法测定铵态氮含量；采用KCl浸提紫外分光光度法测定硝态氮含量；采用钒钼酸铵比色法测定全磷含量；采用火焰光度法测定全钾含量；采用酸碱消煮法测定粗纤维含量；采用梯度稀释平板计数法，无菌操作，在超净工作台中检测堆肥样品中大肠埃希菌的含量；采用麦克马斯特氏法运用饱和食盐水漂浮虫卵，检测每克堆肥样品中寄生虫卵数(oocysts per gram, OPG)。

3、结果与分析

3.1 堆肥过程中温度的变化

结果见125页彩图1。

由125页彩图1可知：在40 d的堆肥过程中，上、中、下层温度整体呈现先升高后降低的趋势。通过检测牛粪发酵堆上层、中层、下层温度，从发酵堆肥第1天开始升温，第1～4天温度呈直线上升，第4天中层温度达到45.8 ℃(>45 ℃)进入高温期；第7 天上层温度达到46.8 ℃,温度持续升高，高温期维持了15 d左右，最高温度达到57.8 ℃;堆肥后期，堆肥温度在第25 天后明显下降，第35天后堆肥温度略低于环境温度，第40天堆肥结束。堆肥过程中，环境温度有一定的波动，最高温度为31 ℃,最低温度为11 ℃。

图1温度变化趋势

3.2 堆肥过程中pH值和水分含量的变化

结果见图2。

图2pH值和水分含量的变化趋势

由图2可知：在整个堆肥过程中，pH值的变化整体呈现先升高后下降的趋势；pH值在第15天升到最高(9.65),在第30天降到最低(9.00);在堆肥后期，堆肥物料的pH值变化不明显，基本稳定在9.10左右。随着堆肥过程的发展，水分含量总体呈现为不断下降的趋势；堆肥样品的初始水分含量为53.53%,堆肥结束时物料的水分含量为27.58%,在整个堆肥过程中水分含量下降了25.95个百分点。

3.3 堆肥过程中有机物含量的变化

结果见表1。

表1堆肥过程中有机物含量的变化情况

3.3.1 有机碳和全氮含量的变化情况

结果见图3。

由图3可知：在堆肥过程中有机碳含量整体呈下降的趋势，第5～15天下降速率较快，10d内下降了150g/kg左右，第15天后下降速率相对平缓；堆肥结束后，有机碳含量降到最低值，为139.65g/kg。全氮含量在堆肥过程中呈现先下降后上升的趋势，堆肥开始时全氮含量最高(14.06g/kg),第0～20天共下降了5.70g/kg,第20天时全氮含量下降到最低(8.36g/kg),第20～40天上升了2.01g/kg。经计算，整个堆肥过程全氮含量总体下降了26.24%。

图3有机碳和全氮含量的变化趋势

3.3.2 碳氮比的变化情况

结果见图4。

图4碳氮比变化趋势

由图4可知，在堆肥过程中，碳氮比整体呈现下降的趋势，碳氮比从堆肥开始时的26.27下降到堆肥结束时的13.47。

3.3.3 铵态氮和硝态氮的变化情况

结果见图5。

由图5可知：铵态氮含量在堆肥过程中呈现先上升后下降的趋势，第0～10天由506.14 mg/kg上升至最高点1 440.13 mg/kg, 第10～40天不断下降至最低点262.85 mg/kg; 硝态氮在堆肥过程中呈增长趋势，堆肥开始时硝态氮含量为最低值303.74 mg/kg, 随后不断升高，到堆肥结束时达到最高值855.34 mg/kg。

图5铵态氮和硝态氮含量的变化趋势

3.3.4 全磷和全钾含量的变化情况

结果见图6。

图6全磷和全钾含量的变化趋势

由图6可知，全磷及全钾含量在堆肥过程中存在轻微的波动，但总体表现较稳定。

3.3.5 粗纤维含量的变化情况

结果见图7。

图7粗纤维含量的变化趋势

由图7可知，粗纤维含量呈现持续下降的趋势，从堆肥开始的24.75%下降至堆肥结束时的10.91%,其中第15～20天的下降速率最快，5 d内下降了5.45个百分点。

3.4 堆肥过程中微生物的变化

结果见表2。

由表2可知，在堆肥过程中，25d内每克堆肥样品中的寄生虫虫卵由开始时的1 200个降低至0;15d内大肠埃希菌含量由4×108cfu/mL降低至0。

表2堆肥过程中微生物的变化情况

4、讨论与结论

4.1 牛粪堆肥过程中温度的变化

温度是整个堆肥过程中最直观的能够体现堆体内部反应的指标，其变化可以直接影响微生物的活动和相关元素的代谢活动，通过温度变化可以清晰地判断堆肥质量[17]。在堆肥过程中，高温条件下嗜热微生物开始活动，分解难以降解的木质素、纤维素等高分子化合物，同时杀灭大量有害微生物和寄生虫虫卵[18];在这个过程中，牛粪中可能存在的抗生素含量也会被大幅度降低甚至消失[19]。如果堆体温度过高会影响相关降解酶的活性；温度过低或高温持续时间过短则对有害微生物和寄生虫虫卵的杀灭作用有限[20]。本研究中，第1～4天为升温期，温度呈直线上升；第7～25天为高温期，最高温度达到57.8 ℃,高温期维持了15d左右；第25～35天为降温期，温度缓慢下降；第35～40天温度维持在一个相对稳定的状态。《国家粪便无害化卫生标准》(GB7959—2012)规定，堆体温度在50 ℃以上保持5～7d(或55 ℃条件下保持3d以上),是杀灭粪便中致病菌和寄生虫虫卵的重要条件。本研究结果不仅与蔡瑞等[21]所研究的最高温度和高温期持续时间结果相似且与《国家粪便无害化卫生标准》相符，说明不添加菌剂的牛粪自然发酵的温度不足以杀灭大多数微生物和寄生虫。

4.2 牛粪堆肥过程中水分含量和pH值的变化

水分在堆肥过程中发挥了非常重要的作用，不仅作为通用的溶剂给微生物提供一个良好的生存外环境，而且能将秸秆、纤维等膨胀软化，更有利于被微生物降解[22]。因此，水分能够直接决定堆肥成功与否。水分过高会影响堆体内部气体交换，堆体内容易形成厌氧环境，影响好氧堆肥的进程[23];水分过低则不利于微生物的生长与代谢[24]。因此，本研究控制堆肥物料的初始水分含量在50%～60%之间[25],随着堆肥过程进行，微生物不断代谢和高温期持续高温蒸发，水分含量呈现不断下降的趋势。本研究中堆肥样品的水分含量从初始的53.53%下降到结束时的27.58%,在整个堆肥过程中水分含量下降了25.95个百分点，符合《有机肥料》(NY/T 525—2021)中水分含量低于30%的要求。

酸碱度是影响堆肥进程的重要指标之一，不适当的pH值条件会使微生物的蛋白质结构发生改变，从而使生命活动受到抑制，最终延缓甚至停止堆肥进程[26]。本研究中，pH值的变化整体呈现先升高后下降的趋势，随着堆体温度的不断升高，堆体内部嗜热微生物活动增强，物料中的有机质被降解导致有机酸挥发，结合氨化作用的加强，使堆体pH值升高[27];但随着温度和pH值的升高，大量铵态氮会转化为NH3挥发[28],到堆肥中后期，随着硝化作用的增强，一部分铵态氮被转化为硝态氮，堆体pH值逐渐下降[29]。本研究观测到的pH值的变化趋势与朱为静等[30]的研究结果相似。结合铵态氮与硝态氮的变化可以看出，pH值与铵态氮的变化趋势相对一致，表明氨化作用对pH值的影响非常关键；同时硝态氮在堆肥后期增长迅速，对pH值的下降也有一定的影响。

4.3 牛粪堆肥过程中有机物含量的变化

堆肥过程中有机物一部分会被微生物转化为二氧化碳和水，一部分会被微生物转化为矿物质和腐殖质[31]。本研究结果显示，在堆肥的第5～15天，有机物的含量下降速度最快，其原因可能是堆肥高温期堆体中有机物含量较高且微生物活动频繁，易分解的有机物被微生物大量利用以维持自身的生长发育和繁殖，因此前中期有机物含量下降较快，与田伟[32]的研究结果相似；而堆肥15 d后，随着有机物含量降低及微生物数量、种类的减少，有机物含量缓慢下降直至趋于平稳。

4.4 牛粪堆肥过程中全氮含量的变化

堆肥过程会引起氮含量发生改变，主要是由于氨化作用、氨同化作用、硝化作用、反硝化作用等[33],其中对氮含量变化影响最大的为氨化作用，该作用使铵态氮挥发为氨气导致氮含量的损失[34]。本研究中，全氮含量在第0～20天持续下降，这个过程主要是发生了氨化作用，而铵态氮又以氨气的形式挥发；而在堆肥的第20～40天，全氮含量又缓慢升高，是因为此时硝化细菌比较活跃，发生硝化作用，硝态氮含量持续升高。

4.5 牛粪堆肥过程中碳氮比的变化

碳氮比是评价堆肥产品是否腐熟的重要指标，其变化能够直观地反映堆肥中有机质的降解和堆肥腐殖化的程度。微生物在生长过程中会消耗大量的碳和氮，碳氮比一般为25～30[35],因此本研究将堆肥样品初始碳氮比设定为25～30。一般认为当堆肥原料的碳氮比小于20时，即可以认为此时的堆肥产品已达到基本腐熟；也可以用堆肥成品的碳氮比与堆肥开始时堆肥原料的碳氮比来确定堆肥的腐熟程度，当其比值小于0.6时，此时的堆肥已经腐熟[36]。本研究结果显示，堆肥初期碳氮比为26.27,堆肥结束时碳氮比为13.47,均符合以上要求，表明添加枯草芽孢杆菌菌剂的牛粪堆肥腐熟效果良好。

4.6 牛粪堆肥过程中全磷和全钾含量的变化

在堆肥过程中全磷和全钾的含量未发生明显变化，但在微生物的作用下，堆体中干物质含量逐渐减少，使得整个试验过程中产生了“浓缩效应”,全磷和全钾的含量相对升高。

5、结论

在牛粪好氧堆肥过程中加入枯草芽孢杆菌菌剂不仅对大肠埃希菌和寄生虫卵具有杀灭作用，而且堆肥产物的各项评价指标均符合相关国家标准要求，可以作为牛粪堆肥添加菌剂。

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基金资助:国家重点研发计划项目(2022YFD1602501);国家肉牛牦牛产业技术体系项目(CARS-37); 宁夏回族自治区农业科技自主创新项目(NGSB-2021-12-05);

文章来源:郭亚男,李珂,王明成,等.枯草芽孢杆菌对牛粪好氧堆肥过程中理化性质的影响[J].黑龙江畜牧兽医,2024,(21):34-40+125.