青光眼已成为全球范围内不可逆致盲眼病的首位原因[1-2],至2040年，预计发病人数达约1.1亿万人，亚洲占比60%,由于视力和视野的储备代偿作用，患者出现明显症状时往往到了中晚期，治疗效果和预后都不容乐观[3-4]。研究表明青光眼滤过术自1968年应用于临床，目前仍然是治疗青光眼的主要手术方式，而滤过泡的形成对于青光眼手术治疗效果评估非常重要，是临床上最直观的体征，即手术能否成功关键在于术后能否形成有功能的滤过泡，然而，由于手术对结膜和巩膜组织的创伤较大，往往刺激手术区受损的结膜和巩膜组织成纤维细胞增殖、活化转变为肌成纤维细胞向伤口处移行，并释放炎症因子α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)、Ⅲ胶原纤维等强表达，从而促使滤过泡的瘫痕形成，滤道被阻塞是导致手术失败的主要原因[5-7]。研究表明一些抗瘢痕形成药物，如皮质类固醇、抗代谢药物、胶原交联抑制剂、抗凝血药物和前列腺素抑制剂等已用于青光眼滤过术的实验及临床研究，且取得一定临床效果[8-9]。特别是丝裂霉素C(mitomycin C, MMC)应用于青光眼滤过术后，其良好的抗瘢痕增殖作用，可以有效抑制滤过泡瘢痕化，从而明显的提高了青光眼术后的成功率[10-11]。但由于MMC易引起伤口渗漏、浅前房、低眼压、眼内炎等术后并发症，目前临床使用受限[12]。随着纳米医学在临床和科研方面研究的深入，研究表明聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic acid hydroxyacetic acid copolymer, PLGA)具有良好的生物相容性和缓释性等特点，目前已经应用于眼科结膜炎、干眼和角膜炎等方面的研究[13-14]。因此，本研究拟将PLGA作为纳米载体，结合MMC合成纳米药物MMC-ATS-@PLGA,拟利用纳米技术降低MMC的药物毒副作用，提高药物在青光眼术后抑制滤过泡瘢痕形成的药物效果。

1、材料和方法

1.1材料

选用MMC作为试验药物，以PLGA和玻璃酸钠(sodium hyaluronate eye drops, ATS)为包封材料制备MMC-ATS-@PLGA。重庆医科大学动物实验中心获得80只雄性健康新西兰大白兔(2.0-2.5 kg, 14-16周龄),实验筛查标准：患有先天性青光眼、白内障、角膜炎、临床或亚临床圆锥角膜、角膜厚度<480μm等眼部病变或疾病的新西兰大白兔被排除在研究之外。所有动物实验均经通过重庆医科大学科学技术伦理委员会批准，并符合ARVO关于动物在眼科和视觉研究中使用的声明标准，并且所有动物实验程序均符合实验动物保护原则。

1.2方法

1.2.1主要试剂和仪器

主要试剂和生产厂家分别为PLGA(上海麦克林生化科技有限公司，中国);甲醇(重庆川东化工集团，中国);PBS(pH=7.5)缓冲液；MMC(西安山川生物科技有限公司，中国)。主要仪器：旋转蒸发仪(上海泰坦生物有限公司，中国);声震仪(Sonics,美国);低温高速离心机(Eppendrof,德国);透射电镜(TEM)(HiTachi,日本);Malvern3000SSA型激光粒径及电位测量仪(Malvern,美国);紫外分光光度计(Shimadzu,日本)。

1.2.2 MMC-ATS-@PLGA的制备

采用薄膜分散-水化超声法(film-dispersion and hydration-sonication method)制备MMC和PLGA的纳米粒(MMC-ATS-@PLGA)[15]。具体步骤：精密称取50 mg的PLGA,10 mg MMC及5 mL三氯甲烷放入100 mL圆底烧瓶中；将圆底烧瓶转移到旋转蒸发仪上(60℃,负压-0.2 kpa, 45 min),得到白色的纳米粒，采用PBS洗脱，冷却，用100 W,5 min(5 s/5 s,开/关)工作模式的声震仪将已形成的纳米粒均匀化，最后用低温离心机(4℃,12 000 r/min)进行纯化，4℃低温避光保存，备用。用同样的方法制备载@PLGA。

1.2.3 MMC-ATS-@PLGA物理化学性质检测

采用马尔文粒径仪测量MMC-ATS-@PLGA和@PLGA的粒径和Zeta电位。将MMC-ATS-@PLGA和@PLGA悬液在室温环境下静置1-7 d,分别检测每天的粒径大小，以评估其稳定性；分别配置不同浓度的丝裂霉素甲醇溶液，通过紫外分光光度计测量其吸收度，根据最大吸光度值确定吸收峰，并且计算各自的浓度-吸光度标准曲线。MMC包封率=载药量/总投入量×100%;MMC载药率=载药量/PLGA总量×100%。同时采用高效液相色谱法测量MMC-ATS-@PLGA在4℃(储存温度)和33℃(眼表温度)情况下的药物释放率。

1.2.4体内生物安全性检测

选取新西兰大白兔右眼作为实验对象，随机分为正常组、氟米龙滴眼液(FML)组、MMC组和MMC-ATS-@PLGA组，每组5眼，模拟临床用药，每日3次(8∶00、15∶00、22∶00)分别予以30μL 0.1%玻璃酸钠滴眼液、氟米龙滴眼液(1 mg/mL)、MMC溶液(1 mg/mL)、MMC-ATS-@PLGA(1 mg/mL),3 wk后予以角膜荧光染色，观察并记录角膜荧光染色情况；随后采用戊巴比妥钠(3%, 1 mL/kg)对模型兔实施耳源静脉麻醉，观察并记录泪膜破裂时间(tear film rupture time, BUT)、泪液分泌试验(Schirmer)和眼压(IOP);最后予以静脉注射大剂量戊巴比妥钠(3%,1 mL/kg)处死动物，取下角膜标本予以HE染色，观察并分析角膜形态学变化。

1.2.5青光眼滤过术动物模型建立

选取新西兰大白兔右眼作为实验对象，予以经典青光眼小梁切除术，随机将实验分为控制组(control)、FML组、MMC组和MMC-ATS-@PLGA组，每组5眼，模拟临床用药，每日3次(8∶00、15∶00、22∶00)分别予以30μL 0.1%玻璃酸钠滴眼液、氟米龙滴眼液(1 mg/mL)、MMC溶液(1 mg/mL)、MMC-ATS-@PLGA(1 mg/mL),另设置未进行手术的新西兰大白兔右眼作为正常组，术前各组兔眼动物模型的年龄、体质量差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2.6 MMC-ATS-@PLGA体内抗瘢痕效果评价

予以药物治疗干预后，采用裂隙灯显微镜观察并记录术后1-3 wk滤过泡的形态学变化，并通过AI智能辅助计算系统，统计分析不同时间点滤过泡大小；术后第3 wk时，采用高浓度CO2将兔处死，取下滤过泡区结膜标本予以HE染色，观察并分析结膜组织形态学变化；同时予以滤过泡区结膜标本免疫组化实验，根据国际多质控中心发布的《国际特设专家委员会建议：诊断免疫组织化学阳性对照标准化》[16],检测并分析滤过泡形成相关的炎症因子α-SMA、CTGF和Ⅲ型胶原纤维的表达情况；最后，提取滤过泡区结膜组织蛋白进行酶联免疫吸附实验(Elisa实验)检测症因子α-SMA、CTGF和Ⅲ型胶原纤维的表达情况。

统计学分析：应用统计软件SPSS 20.0进行分析，对于服从正态分布的计量资料，应首先采用单因素方差分析进行多组间的比较，若存在差异进一步采用LSD-t检验进行组间的两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 MMC-ATS-@PLGA纳米粒表征分析

MMC-ATS-@PLGA纳米粒表面粗糙(图1A),马尔粒径仪显示@PLGA和MMC-ATS-@PLGA粒径在室温条件下长时间监测变化无统计学意义(P>0.05,图1B),物理性质稳定，其中MMC-ATS-@PLGA和@PLGA的平均粒径分别为128.78±2.54、115.74±3.17 nm。本研究进一步分析@PLGA和MMC-ATS-@PLGA平均电位变化，结果显示，与@PLGA(-67.28±6.84)mV相比，MMC-ATS-@PLGA纳米药物合成后，药物表面形成正电荷，其Zeta电位为36.49±4.25 mV(图1C、D);研究采用紫外分光光度计计算药物包封率和载药率，结果显示MMC-ATS-@PLGA纳米粒的包封率为(78.49±2.75)%,载药率为(30.86±1.84)%(图1E);药物释放实验方面，研究表明，MMC-ATS-@PLGA纳米粒在33℃(眼表温度)条件下，600 min累计率高达(76.58±2.68)%,但在4℃(储存温度)条件下，可以稳定存在，释放率仅为(4.69±0.53)%(图1F)。

2.2 MMC-ATS-@PLGA纳米粒眼表生物安全性评估

在药物作用于眼表3 wk后，FML组和MMC组角膜荧光染色呈现出不同程度的点片状着染，但MMC-ATS-@PLGA组角膜未见明显点状着染(图2A);进一步提取角膜进行HE染色，结果显示FML和MMC组呈现不同程度的角膜上皮明显变薄和细胞组织水肿，但MMC-ATS-@PLGA组角膜形态基本接近正常组(图2B)。各组间眼表BUT、Schirmer、眼压差异具有统计学意义(F=178.35、126.79、154.86,均P<0.05),研究显示与正常组BUT(15.48±0.79 s)相比，FML组(9.36±0.82 s)和MMC组(7.83±0.57 s)呈现不同程度的下降趋势，差异具有统计学意义(P<0.05);但MMC-ATS-@PLGA组BUT(15.16±0.54 s)与正常组比较，差异无统计学意义(P>0.05),并且Schirmer试验呈现出与BUT相同的变化趋势。与正常组眼压(14.27±0.79 mmHg)相比，FML组(20.72±1.43 mmHg)眼压明显升高(P<0.05),MMC组(14.12±0.84 mmHg)和MMC-ATS-@PLGA组(14.46±0.85 mmHg)眼压与正常组比较差异无统计学意义(均P>0.05),见图2C-E。

2.3 MMC-ATS-@PLGA纳米粒抑制滤过泡瘢痕形成的形态学分析

术后第1 d,各组均未出现角膜缺损、前房渗出、滤过泡渗漏等并发症，各组均形成功能型滤过泡，形态无明显差异。术后1 wk与术后1 d比较，控制组、FML组、MMC组和MMC-ATS-@PLGA组滤过泡减少量分别为12.78±2.93、10.43±2.58、8.57±1.64、7.03±1.45 mm2,FML组、MMC组和MMC-ATS-@PLGA组滤过泡隆起、弥散，充血明显减轻；随着时间的延长，滤过泡逐渐变小、扁平。术后3 wk较术后1 wk比较，控制组、FML组、MMC组和MMC-ATS-@PLGA组滤过泡减少量分别为21.49±2.37、14.85±2.27、12.38±1.95、9.46±1.73 mm2;MMC-ATS-@PLGA组滤过泡的面积明显大于FML组和MMC组，控制组滤过泡基本消失，见图3。术后3 wk,进一步提取兔眼滤过泡区域的结膜进行病理组织分析，结果显示与正常组相比，MMC组可见大量生成的胶原纤维，且排列不规则，胶原纤维致密且粗大，MMC-ATS-@PLGA组胶原纤维形态相对规则，排列整齐，组织形态基本接近正常组(图4)。

图1 MMC-ATS-@PLGA纳米粒表征分析

2.4免疫组化角度分析MMC-ATS-@PLGA纳米粒抑制滤过泡瘢痕形成的效果

在青光眼滤过术后第3 wk,采用免疫组织化学方法直接测定各组α-SMA、CTGF和Ⅲ型胶原纤维的表达，炎症相关抗体的表达情况计算如下：H-score=∑(pi×i)/100=(弱强度百分比×1)+(中等强度百分比×2)+(强强度百分比×3),结果提示各组α-SMA、CTGF、Ⅲ型胶原纤维比较差异具有统计学意义(F=78.34、94.75、83.65,均P<0.05),与FML组(118.37±2.58)和MMC组(112.86±2.83)中α-SMA的表达相比，MMC-ATS-@PLGA(79.51±2.39)组下降最为明显，与正常组(63.67±1.92)接近。并且炎症因子Ⅲ型胶原纤维和CTGF显示出相同的变化趋势，见图5。

2.5 Elisa实验分析MMC-ATS-@PLGA纳米粒体内抗瘢痕效果

从动物模型中提取滤过泡区结膜组织蛋白用于Elisa实验，结果表明，各组α-SMA、CTGF、Ⅲ型胶原纤维比较差异具有统计学意义(F=118.45、102.54、89.34,均P<0.05),与正常组相比，控制组中α-SMA、CTGF和Ⅲ型胶原纤维抗体的表达水平显著较高，予以FML、MMC和MMC-ATS-@PLGA治疗3 wk后，炎症因子表达逐渐下降，其中MMC-ATS-@PLGA组炎症因子表达下降最明显，差异具有统计学意义(均P<0.05),见图6。

3、讨论

随着人口老龄化，青光眼患者也逐渐增多，对于一些用降眼压药物后眼压控制不良的人群中，青光眼滤过手术仍然是治疗的首选方法，但术后结膜及巩膜瓣的纤维增生及瘢痕化仍然是导致手术失败的主要原因[17-18]。研究表明血小板在受损区域的血管处形成聚集，激活内源性凝血级联反应，进一步刺激释放各种生物活性的生长因子、炎症趋化细胞、成纤维细胞等，随后滤过泡区组织在炎症因子诱导因子(transforming growth factorβ1, TGF-β1)介导下，分泌大量的炎症因子α-SMA、CTGF、Ⅲ型胶原纤维，诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，从而导致伤口收缩并分泌富含胶原蛋白的细胞外基质，最后重塑形成致密的胶原蛋白结膜下肌性瘢痕[19-20]。因此，如何抑制青光眼术后炎症因子表达，对于有效促进滤过泡形成显得格外重要。丝裂霉素C作为青光眼滤过术中使用的抑制纤维增殖的药物，可以有效促进术后滤过泡良好形成，阻止瘢痕形成，但其存在严重的并发症，如伤口渗漏、低眼压、角膜毒性和眼内感染等，故临床使用受限[21]。因此，本研究拟利用纳米医学良好的生物相容性和缓释等特性，合成一种低毒和高效抗炎作用的纳米药物，从而为青光眼术后抗瘢痕增殖提供新的思路。

图2药物作用3 wk后MMC-ATS-@PLGA纳米粒眼表生物安全性评估

图3青光眼滤过术后不同时间点FML组、MMC组和MMC-ATS-@PLGA组不同时间点滤过泡形态变化。

本研究通过薄膜分散-水化超声法成功制备MMC和PLGA的纳米粒(MMC-ATS-@PLGA),并进一步从粒径、电位、包封率、载药率等角度证实该纳米药物的成功合成。马尔粒径仪显示MMC-ATS-@PLGA纳米粒在室温条件下可以在PBS溶液中稳定存在，同时温度释放曲线显示该纳米药物在眼表环境(33℃)具有良好的释放特性；并且MMC-ATS-@PLGA纳米粒表面带正电荷，与眼表带负电荷的细胞膜具有相互吸引作用，可增强细胞对载药纳米粒的摄取，延长纳米药物的眼表滞留时间，从而更好地发挥药物的治疗作用[22]。

图4正常组及FML组、MMC组和MMC-ATS-@PLGA组青光眼滤过术后3 wk结膜HE染色变化。

图5青光眼滤过术后3 wk基于免疫组织化学法分析FML组、MMC组和MMC-ATS-@PLGA组结膜组织中炎症因子α-SMA, CTGF和Ⅲ型胶原纤维表达情况

图6青光眼滤过术后3 wk基于Elisa实验法分析FML组、MMC组和MMC-ATS-@PLGA组结膜组织中炎症因子α-SMA、CTGF、Ⅲ型胶原纤维表达情况

随着纳米医学应用于眼科临床，研究表明PLGA是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域[23]。本研究通过在兔眼药物治疗3 wk后，采用角膜荧光染色进行分析，结果显示MMC组角膜呈弥漫性点片状染色，FML组角膜轻微点片状染色，而MMC-ATS-@PLGA组角膜上皮无明显荧光染色。进一步提取角膜组织进行HE染色，研究发现FML组和MMC组的角膜上皮呈现不同程度的变薄，其中MMC组最为严重。然而，MMC-ATS-@PLGA组的角膜上皮形态没有显著变化。研究进一步分析了药物对眼表泪液分泌的影响，结果显示MMC-ATS-@PLGA组和正常组的BUT和Schirmer测试结果无统计学差异，而FML组和MMC组的BUT和Schirmer结果均小于MMC-ATS-@PLGA组。此外，与长期使用FML容易导致眼压升高相比，本研究表明MMC-ATS-@PLGA对眼压没有影响。同时研究进一步对实验兔的血液进行血常规、肝肾功等指标分析，结果表明该纳米药物不影响实验动物体内白细胞、淋巴细胞、血红蛋白、血小板、丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、肾小球滤过率、肌酐、尿素等指标，同时实验兔心肝脾肺肾等主要脏器的HE染色结果未见明显异常，进一步证实MMC-ATS-@PLGA纳米药物具有良好的生物相容性。

本研究进一步分析青光眼滤过术后1-3 wk不同药物组滤过泡的变化趋势，结果发现控制组滤过泡基本消失，FML和MMC组滤过泡小而扁平，然而MMC-ATS-@PLGA组中的过滤泡凸起，其尺寸符合实验要求。对手术区结膜组织变化进行病理分析，结果显示，与控制组胶原纤维排列紊乱相比，MMC-ATS-@PLGA组结膜组织形态与正常组相似。此外，结膜组织免疫组化和Elisa实验均从蛋白组学角度证实MMC-ATS-@PLGA可有效降低炎症因子α-SMA、CTGF和Ⅲ型胶原纤维的表达，阻止滤过区瘢痕化，从而有效促进滤过泡良好形成。该过程中MMC-ATS-@PLGA特异性作用于细胞增生周期的DNA合成器(S期),通过抑制核糖胸腺苷影响DNA合成，从而显著抑制Tenon囊成纤维细胞增生，维持滤过通道的功能，其效果优于FML[24-25]。

与传统治疗方法相比，在生物安全性方面，通过角膜荧光染色、BUT、Schirmer、眼压和心肝脾肺肾等重要脏器病理解剖分析，均证实MMC-ATS-@PLGA纳米药物的生物安全性优于传统药物；同时进一步从抑制滤过泡瘢痕的效果分析，通过免疫组化和Elisa实验分析各组炎症因子表达情况分析，结果显示该纳米药物抗炎效果优于传统药物，其临床应用前景值得进一步探索，但对于不同类型青光眼患者的适用性和长期效果分析需进一步进行研究。

本研究采用薄膜分散-水化超声法成功合成一种针对青光眼滤过术后抑制滤过泡瘢痕增殖的纳米药物，即MMC-ATS-@PLGA,该药物具有稳定的物理化学性质、良好的生物相容性和更佳的抗炎效果，其通过抑制滤过泡区炎症因子α-SMA、CTGF和Ⅲ型胶原纤维的表达，阻止滤过泡区瘢痕化形成，从而提高青光眼滤过手术的成功率，值得进一步研究。

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基金资助:四川省资阳市医学科学课题计划项目(No.KY2023001,KY2023023);四川省资阳市科学技术局计划项目(No.zykjjsc20-yyjc-2023-04); 2024年度河北省医学科学研究课题计划(No.20240294);四川省老年医学学会研究课题(No.24SCLN0115)~~;

文章来源:李盈,唐娟,李长芬,等.丝裂霉素纳米粒抑制青光眼滤过术后瘢痕增殖的安全性和疗效[J].国际眼科杂志,2024,24(11):1708-1714.