痴呆是全球主要的健康问题，血管性痴呆（Vascular dementia,VD）是导致痴呆的第二大原因，治疗方法包括药物和非药物治疗[1]。经颅重复磁刺激（Repetitive transcranial magnetic stimulation,r TMS）是非入侵性的脑刺激技术，被用于改善阿尔茨海默病、VD导致的神经功能障碍[2]。本课题组前期研究发现：全脑缺血再灌注引起的血管性痴呆大鼠给予高频重复经颅磁刺激（Highfrequency transcranial magnetic stimulation,Hr TMS）后，能改善其学习记忆能力；电生理的实验发现，Hr TMS刺激后海马环路抑制性神经元的功能降低、兴奋性神经递质的释放增多[3]、海马长时程增强（Long-term potentiation,LTP）的诱导幅度增大。因此，为探讨Hr TMS改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力的长期效应是否与刺激引起的突触结构变化相关，本课题组进行了研究，观察Hr TMS刺激后海马神经元的形态、脑源性神经营养因子（BDNF）、微管相关蛋白2(MAP2）的变化。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验对象及分组

78只雄性Wistar大鼠（SPF级，厦大翔安校区动物实验中心提供，体质量220～250g，实验动物伦理许可证号：XMU-LAC20220081）；根据随机数字表法将其分为假手术组、模型组、Hr TMS组，每组26只；每组分为2个亚组（术后4 d组、术后18d组，每个亚组13只，其中5只做HE染色，8只完成行为学评定及免疫组化测定）。过程中如动物死亡将补充大鼠。实验依托于厦门市康复技术转化重点实验室平台。

1.1.2主要试剂与仪器

MAP2、BDNF一抗工作液（兔抗大鼠抗体，Abcam，英国），HRP标记抗鼠二抗、抗兔二抗（北京全氏金生物），免疫组化(DAB)试剂盒、苏木素染色液（福州迈新生物）；经颅磁刺激仪（NS5000，依瑞德，武汉）、TMS刺激线圈（型号Y064，尺寸：64 mm×64 mm×30 m动物科研线圈）（依瑞德，武汉），双臂脑立体定位仪（型号51603,Stoelting，美国），Morris水迷宫系统（型号ZH-1，安徽正华，合肥），正置生物显微镜（型号：Axio Scope A1，苏州ZEISS),IPP7.0图像分析软件（美国），等。

1.2方法

1.2.1实验动物建模

用改良的四血管夹闭法制作全脑缺血再灌注模型（Four-vessel occlusion,4VO)[4]，该模型分2步。第1步，电凝双侧椎动脉：将Wistar大鼠麻醉后固定，在C1棘突做纵行切口，暴露双侧C1横突上的翼孔，随后闭塞椎动脉，缝合皮肤；第2步，夹闭颈总动脉：取仰卧位，颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，对其进行宽松打结后缝合，术后禁食，可饮水。24 h后，剪开缝合口，轻拉双侧颈总动脉后夹闭，如在15 s内出现意识丧失、光反射及翻正反射消失、瞳孔散大，即为成功，10 min后去除缝线、缝合。

3组均采用改良的4VO法制备全脑缺血大鼠模型，假手术组只分离暴露血管而不对其进行处理。

1.2.2静息运动阈值（resting motor threshold,r MT）测定

术后第3 d从Hr TMS组抽取5只大鼠进行r MT测定（随机数字表法），麻醉后固定，用同芯针电极记录双侧股二头肌信号，刺激线圈平行置于其头皮上，用60%刺激强度刺激，同时缓慢移动线圈直至仅在对侧股二头肌记录到MEP；调整强度至MEP不再升高，即为最大MEP，随后缓慢减小刺激强度，直到出现的MEP为最大MEP波幅的5%，将该刺激强度设为r MT。

1.2.3 Hr TMS治疗

仅对Hr TMS组进行治疗。术后第4 d开始，固定大鼠头部，线圈外侧对准人字缝，放在前囟及人字缝中间，参数：频率10 Hz，连续5S，间隔30S，重复6次；2次/d，连续治疗14 d[5-6]。

1.2.4行为学评估

在术后第18 d，用Morris水迷宫检测学习、记忆能力。Morris水迷宫水池被划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四个象限，平台在Ⅲ象限。参考Hong等[6]的方法，每天进行4次定位航行实验，每次间隔20 min，连续5 d，记录逃避潜伏期。以上实验结束后1 d将去除平台，随后行空间探索实验，记录大鼠穿过原有平台的次数。

1.2.5标本采集

分别于术后第4 d、术后第18 d，先采集腹主动脉血后暴露大鼠心脏，左心室盐水灌洗后，再行缓冲液灌注固定，后冰上迅速全脑，使用4%多聚甲醛液体固定脑组织，后进行常规包埋、切片，用于HE染色及免疫组化染色。

1.2.6 HE染色法观察海马神经元形态

大鼠结束相应的水迷宫实验后，使用显微镜镜检（200倍），图像采集分析观察海马神经元形态，结果：细胞核呈蓝色，细胞质呈红色。

1.2.7免疫组织化学染色法检测MAP2、BDNF

分别采用MAP2、BDNF一抗工作液（工作浓度MAP2为1∶200;BDNF为1∶200），标本经过PBS冲洗、滴加二抗工作液、PBS冲洗、滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液、PBS冲洗、DAB显色剂显色、冲洗、复染、PBS返蓝、酒精脱水、透明、薄片后使用显微镜观察。采用正置生物显微镜观察MAP2、BDNF切片，IPP7.0图像分析软件采集大鼠海马CA1区的免疫信号。本研究选用平均光密度（Mean optical density,MOD）值，使用校正光密度值（Corrected optical density,COD）进行量化分析。

1.3统计学分析

数据采用SPSS 20.0统计分析，数据以均值±标准差（Mean±SD）表示。计量资料多组间均数差异符合正态分布用单因素方差分析，多样本均数间两两比较方差齐则应用LSD检验，方差不齐时应用Games-Howell检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 r TMS对改良4VO大鼠学习、记忆能力的影响

在定位航行实验中，大鼠的逃逸潜伏期在实验第5 d时Hr TMS组和假手术组短于模型组（F=16.230,P<0.01）；在空间探索实验中，大鼠在60 s内穿过原有平台的次数，Hr TMS组和假手术组多于模型组（H=12.985,P<0.01）（表1）。

表1各组大鼠术后18 d Morris水迷宫实验结果（Mean±SD)

注：*模型组与假手术组同时间点比较,*P<0.05；#模型组与Hr TMS组同时间点比较,#P<0.05；△与假手术组穿越平台次数比较,△P<0.05

2.2 r TMS对改良4VO大鼠海马CA1区细胞影响

从HE染色图1可看出，假手术组：海马CA1区细胞没有明显的组织病理学变化：神经细胞形态、数量正常，结构完整，核仁清晰；模型组：海马CA1区神经细胞脱失明显，细胞化萎缩，细胞间结构松散，整个细胞深染；Hr TMS组：海马CA1区可见散在神经细胞变形萎缩，排列紧密性明显好转，细胞脱失较模型组明显减少。

2.3 r TMS对改良4VO大鼠BDNF、MAP2的表达的影响

由免疫组织化学染色的检测图2可见，BDNF免疫组化阳性物质呈棕褐色圆形、长条形或不规则多角形表达。表2可见，术后第3 d,3组大鼠BDNF表达进行组间比较，差异无统计学意义（P>0.05),r TMS治疗14 d后即术后第17 d,Hr TMS组的BDNF表达显著高于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。

由图3可见，光学显微镜下见MAP2免疫组化阳性物质为细胞胞浆或胞核呈棕黄色或浅黄色为阳性表达。表2可见，术后3 d,3组大鼠MAP2表达进行组间比较，差异无统计学意义（P>0.05),r TMS治疗14 d后，Hr TMS组的MAP2表达显著高于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。

图1各组大鼠术后第17 d海马CA1区CA1区组织病理学变化（HE染色，×200)

图2各组大鼠不同时间点CA1区BDNF表达情况（免疫组织化学染色，×200)

表2各组大鼠CA1区各指标COD值比较（Mean±SD)

3、讨论

3.1 r TMS对VD大鼠海马突触结构可塑性的影响

VD指一种由各种脑血管病导致的以学习、记忆等功能障碍为主的获得性认知障碍综合征[7-8]，目前尚无特异临床防治措施，为此，找寻有效解决手段十分重要。

目前，对VD的治疗有药物、认知训练及降低危险因素等。r TMS具有安全性高、副作用少、操作简单等优点，其作为一种无创治疗技术，可通过刺激大脑皮质产生感应电流，影响皮质神经细胞的动作电位改变脑代谢和神经活动，从而提高大脑兴奋性[9-10]，临床研究也发现认知康复训练配合高频重复经颅磁刺激治疗干预措施医治效果更好。

我们前期在用Morris水迷宫检测10Hz r TMS治疗对4VO模型大鼠学习记忆能力影响的研究中，发现高频r TMS工作原理主要是通过调节海马齿状回中间神经元的功能状态，以增强颗粒细胞的兴奋性从而促进LTP，增强大鼠学习记忆能力。我们还观察了高频r TMS对突触结构可塑性的影响，本研究检测了海马CA1区BDNF及MAP表达情况。本研究免疫组化结果提示模型组、Hr TMS组的BDNF、MAP2表达在脑缺血后较假手术组明显下降；与模型组相比，Hr TMS组大鼠海马CA1区BDNF、MAP2表达明显增强，这表明高频r TMS可上调BDNF、MAP2水平，促进其脑缺血后突触可塑性，并有效改善大鼠神经行为学评分。HE染色提示模型组、Hr TMS组细胞较假手术组存在组织病理学变化，Hr TMS组神经细胞脱失较模型组明显减少，这提示高频r TMS对中枢神经具有保护作用。

图3各组大鼠不同时间点CA1区MAP2表达情况（免疫组织化学染色，×200)

A1.假手术组3 d;B1.模型组3 d;C1.Hr TMS组3 d;A2.假手术组17 d;B2.模型组17 d;C2.Hr TMS组17 d

3.2 r TMS对VD大鼠海马BDNF和MAP2的影响

本研究的免疫组织化学结果表明，模型组大鼠海马BDNF、MAP2表达较假手术组降低，Hr T-MS组大鼠海马BDNF、MAP2表达较模型组增加，说明脑缺血后BDNF、MAP2表达减少，Hr TMS能促进海马神经元BDNF、MAP2表达，增强海马神经元的突触可塑性，改善学习记忆障碍。海马是与学习、记忆相关的重要部位，海马CA1区锥体细胞与神经认知功能密切相关[11]。突触可塑性参与学习记忆、神经系统的发育、损伤后修复等的完成[12]，其表现为LTP和长时程抑制（Long-term depression,LTD），而LTP是形成学习记忆的神经基础[13]。BDNF是空间学习记忆所必需物质，可特异性地增强突触后致密物上的NMDAR受体亚单位NMDAR 1和NMDAR 2B的磷酸化，进而促进LTP的产生[14]。另外，BDNF可调控树突、轴突生长，影响突触结构可塑性[15]。

本研究显示，Hr TMS使BDNF升高的同时，MAP2也有所升高。MAP2是重要的细胞骨架蛋白，存在于神经元胞体和树突突触后致密区中，研究发现MAP2与认知功能密切相关[16],MAP2是多种蛋白激酶的底物，包括c AMP依赖蛋白激酶、Ca MKII以及ERK1/2等[17]。

3.3海马参与空间学习记忆

目前认为海马是控制记忆及学习行为形成的主要结构之一，其突触发生及其可塑性可直接地影响学习记忆功能，尤其是空间记忆功能。水迷宫主要用于研究大鼠的空间学习、记忆[18]。因此，本研究采用水迷宫检测大鼠的空间学习、记忆能力，得出结果提升Hr TMS组大鼠的逃避潜伏期明显短于模型组，而在空间探索实验中，Hr TMS组大鼠在60 s内穿过原有平台的次数多于模型组，表明Hr TMS可改善VD大鼠学习记忆能力。

3.4高频r TMS对VD大鼠海马神经保护作用

本实验选取高频r TMS干预短暂全脑缺血大鼠海马。既往的研究表明，低频和高频r TMS均可增强患者认知功能[6,19-20]。Hong等[6]使用r TMS对脑缺血模型大鼠干预，对比了1、5或10 Hz后发现10Hz r TMS可调节脑缺血模型中的星形细胞极化以促进功能更好恢复。任丽君等[21]研究发现，高频r TMS可能通过增强海马CA1区θ和γ振荡和提高海马PKA、p CREB蛋白表达，增强海马神经元突触可塑性，从而改善全脑缺血大鼠的学习记忆功能，这与本研究结果一致。

综上所述，本研究发现高频r TMS的机制可能是BDNF升高，诱发LTP增强，增加Ca MKII磷酸化，激活多种突触后致密物的蛋白，引起MAP2磷酸化水平增加，促进突起分支形成，从而增加神经元间有效突触连接[22]，最终促进VD大鼠空间学习记忆能力恢复[23]。

作者贡献声明

赵嘉培负责文章撰写、修改；赵嘉培、陈善佳、黄吉莉负责课题实施和总结；陈善佳协助文章审阅；何晓阔负责课题设计、组织实施和审阅

参考文献:

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[9]舒璇,刘淑芬,陈丽霞.非侵入性脑刺激技术在神经系统疾病康复中的应用进展[J].华西医学,2021,36(5):566-571.

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基金资助:福建省自然科学基金计划项目(2022D010);厦门市医疗卫生重点项目(3502Z20234005);厦门市医疗卫生指导性项目(3502Z20214ZD1262);医学科研计划项目(2023YJ001);

文章来源:赵嘉培,陈善佳,黄吉莉,等.高频重复经颅磁刺激对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的影响及机制[J].解剖学研究,2024,46(05):483-488.