给我们留言
91学术服务平台

您好,欢迎来到91学术官网!业务合作:91xueshu@sina.com,站长邮箱:91xszz@sina.com

发布论文

论文咨询

类风湿关节炎合并肺间质病变小鼠模型复制与评价

  2024-06-26    83  上传者:管理员

摘要:目的 复制小鼠胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型、胶原诱导性关节炎联合一次性气管滴注博来霉素诱导肺纤维化(collagen-induced arthritis combined with bleomycin-induced pulmonary fibrosis model,CIA-BLM)复合模型,并进行两种动物模型的肺间质病变评价。方法 15只DBA-1小鼠随机分为空白组(NC)、模型组(CIA)、复合模型组(CIA-BLM),每组5只。采用足趾肿胀度、关节炎指数(arthritis index,AI)评分、HE染色、马松(Masson)染色、关节及肺部影像学、肺功能等指标对模型进行评价。结果 与NC组比较,CIA、CIA-BLM组小鼠体质量、足趾肿胀度、AI评分均下降(P<0.01)。相比NC组,CIA组及CIA-BLM组小鼠组织病理学均显示肺组织结构异常,肺泡壁增厚,炎性细胞浸润,CIA-BLM组较CIA组小鼠有明显蓝色胶原纤维沉积。微计算机断层扫描技术(micro-computed tomography,Micro-CT)示两个模型组小鼠关节破坏均严重。CIA组小鼠肺部影像学示局部磨玻璃样表现,CIA-BLM组小鼠以絮状影、网格状阴影、支气管牵拉扩张为主要表现。两个模型组小鼠均有肺功能下降。结论 CIA模型和CIA-BLM模型均有关节破坏特点和肺纤维化特征,根据组织病理学、影像学、肺功能检测结果,CIA-BLM模型肺纤维化特征更明显。

  • 关键词:
  • 动物模型
  • 博来霉素
  • 滑膜炎
  • 类风湿关节炎
  • 类风湿关节炎合并肺间质病变
  • 加入收藏

类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是一种以滑膜炎为病理基础的慢性、对称性、侵蚀性自身免疫性疾病,临床表现为多关节肿痛、晨僵等症状,后期可出现关节畸形、脏器等多系统受累表现,其中肺部受累是RA最普遍的关节外表现,影响10%~60%的患者[1]。在高达20%的RA患者中,肺部疾病可能先于关节疾病出现[2]。肺部受累可表现为肺间质病变(interstitiallungdisease,ILD)、胸腔积液、细支气管炎、支气管扩张等。多项关于类风湿关节炎合并肺间质病变(rheumatoidarthritis-associated interstitiallungdisease,RA-ILD)的研究表明其患病率为3.6%~58%,但因研究中使用的检测方法和诊断标准不同使其报告结果具有异质性。并且与无ILD的RA患者相比,RA-ILD与患者不良预后也明显相关,RA-ILD患者中位生存期2.6年,是RA患者死亡的主要原因之一[3,4,5,6]。由于缺乏随机临床试验和特定的治疗指南,RA-ILD在治疗方面存在争议,其预后因素也尚无共识[7]。为更好地了解RA-ILD病因、发病机制、预后及治疗方法,复制并评价RA-ILD实验动物模型具有重要意义。本研究复制的两种模型为常应用于RA-ILD肺病理学的免疫刺激剂诱导动物模型。一种为胶原诱导性关节炎(collageninducedarthritis,CIA)模型,另一种模型在CIA基础上联合一次性气管滴注博来霉素(bleomycin,BLM)诱导肺纤维化构建CIA-BLM模型来模拟小鼠ILD的病理改变[8,9]。本文基于RA-ILD小鼠模型复制及评价,探讨这两种常用RA-ILD动物模型的疾病特征,为研究RA-ILD的发病机制和临床治疗提供实验基础。本研究实验方案已通过北京中医药大学实验动物伦理委员会审批,编号:BUCM-4-2020092806-3106。


1、材料


1.1动物

15只SPF级DBA-1雌性小鼠,6~8周龄,体质量(17±2)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:SYXK(京)2023-0011。饲养环境为室内温度25℃,湿度50%,昼夜对半循环照明,动物自由摄食饮水。

1.2药物

博来霉素,由北京百瑞极生物科技有限公司提供,批号:BN20420,规格:125 mg。

1.3主要试剂与仪器

完全弗氏佐剂(货号:7009),美国Chondrex公司;牛Ⅱ型胶原(货号:20022),美国Chondrex公司;HE染色试剂盒(货号:B1002)、马松(Masson)染色试剂盒(货号:B1002),武汉百仟度生物技术有限公司;Brukerskyscan1276型台式活体成像微计算机断层扫描技术(micro-computedtomography,MicroCT)系统,德国布鲁克公司;Buxco型Fine Pointe全身体积描记系统,美国DataSciencesInternational公司;NikonEclipse型光学显微镜,日本尼康株式会社。


2、方法


2.1分组与模型复制

将小鼠随机分为空白组(NC)、模型组(CIA)、复合模型组(CIA-BLM),每组5只。造模试剂制备:将牛Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂等比例混匀,配制浓度为2 mg/m L的胶原乳剂[10]。CIA组和CIA-BLM组小鼠均在尾根部皮下注射0.2 m L胶原乳剂构建CIA模型,初次免疫记为d 0,d 7以同样造模剂同等剂量避开初次免疫造模处进行加强免疫。CIA-BLM组小鼠在d 1时一次性经气管滴注博来霉素溶液,操作步骤如下:小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后固定于小动物气管插管平台,将小鼠舌头从口角稍许拉出固定,冷光源照射小鼠颈部,暴露声门裂后快速插入气管插管针,固定,移液枪吸取相应剂量博来霉素溶液迅速气管滴注,滴注结束后快速出针,小鼠纵轴旋转使药液在肺内均匀分布,后将小鼠置于保温毯上待其苏醒。NC组和CIA组d 1时一次性气管滴注0.9%氯化钠溶液。模型组小鼠均出现关节肿胀后观察30 d取材,NC组观察时间与模型组保持一致。

2.2足趾肿胀度测定

每天观察小鼠精神状态、呼吸、活动、毛发色泽与摄食饮水情况,每3天称取一次小鼠体质量并使用游标卡尺测量小鼠后肢肿胀度,取双后肢测量数值的平均数。

2.3关节炎指数(arthritisindex,AI)评分

自初次免疫后,每3天相同时间段观察小鼠四肢关节肿胀情况,并进行AI评分。每次记录小鼠四肢的评分并相加,累计最高评分为16分。0分:无红肿;1分:趾关节红肿;2分:趾关节足趾肿胀;3分:踝关节以下足爪肿胀;4分:踝关节及所有足爪肿胀,关节严重变形[11]。

2.4关节及肺组织病理学观察

小鼠处死后,取后肢用于HE染色观察踝关节病理改变,取肺组织进行HE染色与Masson染色,分别观察肺泡炎与纤维化程度。

2.5影像学扫描与图像重建

于取材前1 d使用Micro-CT扫描小鼠肺部,进行影像学观察。检查前受检小鼠不禁食,不禁水。检查时小鼠用异氟烷气体诱导麻醉,仰卧位胶带固定于检查床上,面罩遮于口鼻处以维持气体麻醉,使其四肢伸展,肺部充分暴露进行扫描。取材后将小鼠左后肢用胶带固定于检查床进行Micro-CT扫描。对小鼠肺部和关节图像进行三维重建。

2.6肺功能检测

使用Fine Pointe全身体积描记系统检测小鼠肺功能。将小鼠放入扫描腔体内,保证4个描积腔体密闭良好,系统校正,设置小鼠适应时间10 min,因小鼠肺功能检测时无药物干预,所以设置雾化时间0 s,反应时间5 min,恢复时间1 min,此即完成1次肺功能检测。检测指标包括小鼠潮气量(tidal volume,TV)、每分钟通气量(minutevolume,MV)、在50%TV点处的呼气流量(50%tidalvolume expiratoryflow,EF50)等。各指标均取平均值。

2.7统计学方法

应用SPSS26.0统计学软件分析数据,正态分布数据以均值±标准差(±s)表示,方差齐时采用单因素方差分析,方差不齐时用Welch检验,以P<0.05代表差异具有统计学意义。


3、结果


3.1一般情况与足趾肿胀度变化

NC组小鼠毛色光亮,精神状态好,呼吸正常,正常进食饮水,体质量逐渐增加;CIA-BLM组小鼠除出现呼吸急促外,与CIA组小鼠均出现毛色不华,精神不振,活动减少,进食饮水减少,体质量逐步下降。与NC组比较,两个模型组随着时间增加体质量逐渐下降,差异均有统计学意义(P<0.01)。关节肿胀度方面,NC组小鼠无关节肿胀,活动灵活。与NC组比较,模型组小鼠踝关节、足趾均出现不同程度肿胀,发红,活动不利,甚至关节畸形丧失活动能力,差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

图1各组小鼠体质量与足趾肿胀度变化  

3.2 AI评分比较

NC组小鼠无关节肿胀,AI评分为0分。图2示,与NC组比较,两个模型组小鼠AI评分均显著上升(P<0.01)。

图2各组小鼠AI评分比较

3.3组织病理学改变

踝关节HE染色结果显示,NC组小鼠关节未见明显病理改变,滑膜结构正常,无滑膜增生。与NC组比较,各模型组小鼠关节滑膜组织结构异常,大量炎性细胞浸润,滑膜增生,关节腔内可见炎性渗出物,CIA-BLM组较CIA组关节结构破坏严重。肺组织HE染色及Masson染色可见NC组小鼠肺组织结构正常,视野可见肺泡壁厚度均匀,肺泡壁上可见丰富的毛细血管,肺泡结构清晰,未见萎缩;支气管上皮细胞排列规则,未见明显脱落,组织未见水肿和炎性细胞浸润,无明显蓝色胶原纤维沉积。相比NC组,各模型组均见肺组织结构异常,视野内肺泡排列紊乱,各肺泡边界模糊,部分肺泡上皮细胞增生,肺泡萎缩并伴随肺泡壁增厚,组织可见大量炎性细胞浸润,观察到蓝色胶原纤维大量沉积,CIA-BLM组较CIA组蓝染的纤维条索和胶原沉积更明显。见图3。

图3小鼠组织病理学变化  

3.4关节及肺部影像学表现

对各组小鼠进行踝关节及肺部Micro-CT扫描。NC组小鼠关节未见明显破坏,关节结构完整。与NC组比较,各模型组小鼠均见骨表面粗糙,骨侵蚀显著,关节间隙消失。NC组小鼠双肺完整,外观光滑饱满,可见大小气道及相邻血管。CIA组肺部外观较CIA-BLM组完整,冠状面有少许磨玻璃样阴影。CIA-BLM组小鼠肺部外观异常,冠状面可见絮状影、网格状病变、支气管牵拉扩张等影像学改变。见图4。

3.5肺功能改变

NC组小鼠肺功能正常。与NC组比较,CIA组小鼠肺功能下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与NC组比较,CIA-BLM组小鼠TV减少,MV与EF50显著降低(P<0.01),提示气道阻力增加,肺通气功能明显下降。见图5。

图4小鼠关节、肺影像学比较  


4、讨论


ILD是RA中常见的关节外表现,ILD病理以弥漫性肺实质病变、气体交换受损以及肺泡间隔纤维化损伤为特征,表现出劳力性呼吸困难、持续性干咳、全身疲劳和虚弱等症状[12,13]。RA-ILD患者生活质量持续下降,经济负担重,通过动物模型进行疾病机制探索,进一步研发靶向药物对RA-ILD的防治具有重要意义,但该疾病目前尚无广泛被接受的动物模型[8]。有研究者以CIA模型鼠探讨RA-ILD机制,研究中发现CIA模型鼠的病理学有肺组织结构异常、肺泡塌陷、肺泡壁增厚、炎症细胞浸润、肺部纤维化等表现,提示CIA可构建RA-ILD模型[14,15,16,17,18]。另有研究表明CIA-BLM模型表现为肺组织肺泡炎、肺泡结构紊乱、胶原纤维沉积及纤维灶形成[19,20]。CIA-BLM模型以BLM作为诱导肺纤维化药物,且其诱导的肺纤维化组织学上表现为肺结构及肺泡上皮细胞损伤、纤维化灶形成,更符合人类肺纤维化病理发展趋势而被广泛应用于肺纤维化造模[21,22,23]。所以本研究以该方法复制模型,并基于以往研究选用RA-ILD两种模型常用的DBA小鼠[8]。为减少动物损伤,CIA-BLM造模方式为无创气管一次性滴注给药。造模后通过观察小鼠病理学改变、影像学表现及肺功能水平比较这两种模型中发生的ILD肺部受累情况。

图5小鼠肺功能变化比较  

本研究中踝关节HE染色示NC组小鼠滑膜组织结构正常,无炎性细胞及明显增生。模型组小鼠踝关节皆有滑膜组织结构异常,滑膜增生,滑膜细胞数量增加,炎症浸润,其中CIA-BLM组小鼠滑膜组织结构重度异常,炎症反应较重。观察小鼠肺组织HE染色及Masson染色发现,NC组小鼠肺组织结构轮廓清晰完整,未见炎性细胞及胶原纤维。CIA组肺组织结构异常,肺泡结构破坏并伴有炎性细胞,胶原纤维沉积较少。CIA-BLM组较CIA模型组肺部肺泡炎程度更重,肺泡结构紊乱,大量炎性细胞浸润,肺野内可见大量蓝色胶原纤维沉积。这与陈孟毅等的发现一致,他们的研究还表明BLM诱导的小鼠肺纤维化与临床ILD患者的肺组织病理相似[24]。ILD患者早期肺部可见炎性细胞不断增多导致肺泡炎,之后随着疾病进一步发展,正常肺组织被破坏,基质胶原大量出现。张丹参等[22]学者也有相似结论,认为BLM所致小鼠肺纤维化的病理变化更符合ILD患者病理表现。

临床实践中高分辨率计算机断层扫描(highresolutioncomputedtomography,HRCT)可用于诊断ILD[25],RA-ILD患者最常见的胸部HRCT特征包括网状结节变化、磨玻璃影、胸膜增厚、肺气肿等[26],根据这些基本特征该病可分为两种常见亚型,一种为普通间质性肺炎(usualinterstitialpneumonia,UIP),以蜂窝状斑片异质纤维化和活跃的成纤维细胞灶为特征[27],另一种为非特异间质性肺炎(nonspecificinterstitialpneumonia,NSIP),以肺泡壁明显增厚、炎症及纤维化为特征。本研究采用小动物Micro-CT检测小鼠肺部影像学改变。因采用活体小动物进行检测,成像质量受小动物生理活动制约,为保证成像分析效果,构建肺部三维图像和冠状图体现小鼠全肺状态,并观察小鼠是否具有以上特征性影像学表现。本实验NC组小鼠肺部外形完整光滑,无肺实变、炎症及纤维化表现。造模后CIA组小鼠肺部外形大致正常,冠状面可见少许磨玻璃影,肺部受累程度较轻。CIA-BLM组小鼠冠状面可见高密度影,小范围肺实变,造模后急性炎症反应逐渐变为以支气管扩张为主的慢性病变,絮状影和网状影存在,表明肺间质出现病变。CIA-BLM组小鼠肺部成像结果表现出与RA-ILD患者HRCT类似的图像特征。

在肺纤维化中由于肺组织弹性、顺应性降低,气道阻力增加,常表现出潮气量减小、浅快呼吸的呼吸形式、肺通气功能下降,以及气道出现不同程度阻塞[28,29,30]。研究中测定了小鼠肺功能TV、MV、EF50的数值,结果显示CIA组与CIA-BLM组小鼠均有肺功能下降。CIA-BLM组小鼠肺通气不足,MV降低与小鼠出现呼吸频率增快甚至呼吸急促的表现相符,EF50下降反映小鼠有异常气道阻力,出现通气障碍,以上肺功能检测结果说明CIA-BLM小鼠表现出肺纤维化。

综上所述,CIA和CIA-BLM造模方法均有RA关节和肺间质病变的病理表现,组织病理学、影像学及肺功能结果提示BLM诱导的CIA-BLM模型较CIA模型肺纤维化程度更重,肺部病变呈现进行性不可逆性,与人类RA-ILD病理过程更相近。


参考文献:

[10]姚传辉,姜泉,夏聪敏,等.基于骨耦联平衡探讨中药复方对CIA大鼠骨保护的作用机制[J].中国中医基础医学志,2023,29(4):598-603.

[11]朱健,武璐璐,张全书,等.枫杨乙醇提物对胶原诱导性关节炎大鼠的治疗作用及其机制研究[J].中国药理学通报,2019,35(1):117-123.

[14]席雅婧,康天伦,钱唐亮,等.芍甘附子汤加味对胶原诱导性关节炎大鼠肺间质病理及血清KL-6、IL-6与IL-17表达水平的影响[J].吉林中医药,2022,42(6):703-707.

[15]赵凯,常志芳,王志华,等.基因沉默肽基精氨酸脱亚胺酶4的表达对胶原诱导关节炎小鼠肺间质病变的影响[J].北京大学学报(医学版),2021,53(2):235-239.

[16]高波. CXCR4受体在类风湿性关节炎相关间质性肺病的作用机制研究[D].昆明:云南大学,2019.

[18]付蓓蓓,陆雨琳,陈萌檬,等. TGF-β/Smad信号通路在类风湿性关节炎相关的间质性肺纤维化小鼠中的作用[J].中国药理学通报,2023,39(3):483-488.

[19]符亚璐,戎梦瑶,朱平,等.小鼠间质性肺病循环纤维细胞的水平与肺部炎症和纤维化有关[J].细胞与分子免疫学杂志,2014,30(8):814-818.

[20]欧慧萍.基于Wnt/β-catenin信号通路研究类风湿关节炎并间质性肺疾病的机制及归芪补肺汤的干预作用[D].长沙:湖南中医药大学,2023.

[22]张丹参,马佳呈.诱发肺纤维化动物模型方法及评价[J].神经药理学报,2019,9(6):15-20.

[24]陈孟毅,林帅,杜朋,等.博来霉素气管多次给药诱导小鼠肺纤维化模型[J].中国医药导报,2017,14(2):8-11.

[29]李树民,张敏,王朋,等.小鼠无创性肺功能的测定及其意义[J].中国实验动物学报,2018,26(5):548-553.


基金资助:中央高水平中医医院临床科研业务费-中央高水平中医医院临床研究和成果转化能力提升项目(HLCMHPP2023087,HLCMHPP2023014);国家自然科学基金项目(82230121);


文章来源:尚碧月,姜泉,夏聪敏,等.类风湿关节炎合并肺间质病变小鼠模型复制与评价[J].中国中医基础医学杂志,2024,30(06):959-963.

分享:

91学术论文范文

相关论文

推荐期刊

网友评论

我要评论

中国中医基础医学杂志

期刊名称:中国中医基础医学杂志

期刊人气:10041

期刊详情

主管单位:国家中医药管理局

主办单位:中国中医研究院基础理论研究所

出版地方:北京

专业分类:医学

国际刊号:1006-3250

国内刊号:11-3554/R

邮发代号:80-330

创刊时间:1995年

发行周期:月刊

期刊开本:大16开

见刊时间:一年半以上

论文导航

查看更多

相关期刊

热门论文

【91学术】(www.91xueshu.com)属于综合性学术交流平台,信息来自源互联网共享,如有版权协议请告知删除,ICP备案:冀ICP备19018493号

400-069-1609

微信咨询

返回顶部

发布论文

上传文件

发布论文

上传文件

发布论文

您的论文已提交,我们会尽快联系您,请耐心等待!

知 道 了

登录

点击换一张
点击换一张
已经有账号?立即登录
已经有账号?立即登录

找回密码

找回密码

你的密码已发送到您的邮箱,请查看!

确 定