胃溃疡（gastric ulcer,GU）是常见的胃肠道疾病之一，每年影响全球超过1万人口，其严重则可能引起胃出血、胃穿孔，甚至也有产生癌变的倾向[1]。近年，由于生活水平的提高以及饮食习惯的改变，GU的发病趋于年轻化，并且发病率有所上升。尽管目前现代医学治疗GU的手段能在一定程度上缓解胃黏膜损伤的状况，但仍有复发率高、不良反应明显的局限性[2]。

黄芪建中汤是记载于《金匮要略》的经典方剂，其基于GU脾胃虚寒之病机和“脾主卫”的理论组方，临床治疗GU效果满意[3,4]。研究发现，黄芪建中汤有抗炎和促进胃黏膜修复与愈合的作用[5,6]，然而其具体机制有待进一步研究。

GU发病机制尚未完全明了，胃黏膜防御机制和攻击机制的失衡是诱导其发病的关键[7]。研究表明[8,9,10],HGF/c-Met通路在胃上皮细胞广泛分布，是介导PI3K/AKT信号途径的起始点；HGF与c-Met受体结合后，c-Met自身的酪氨酸发生磷酸化，进而激活PI3K/AKT信号通路中的关键分子，进而调节细胞增殖、分化、迁移及有丝分裂等多个过程，发挥修复黏膜损伤、调节免疫的功能。研究证实[11]，白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18）、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α）均为促炎因子，其释放过多可产生炎症反应，诱发或加重GU。本研究旨在通过检测GU模型大鼠血清炎症因子及胃组织中HGF、c-Met、PI3K、AKT、EGFR等的表达，探讨黄芪建中汤治疗GU的作用机制。

1、材料

1.1实验动物

7周龄Wistar大鼠60只，均为雄性，体质量190～210 g。实验动物购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[SCXK（湘）2019-0004]。分笼喂养于湖南中医药大学动物实验中心（清洁级），温度为24～26℃且湿度维持在50%～70%，明暗各12 h/d，喂普通的饲料，自由摄水。本研究由湖南中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准（ZYFY20190120）。

1.2药物及制备

奥美拉唑肠溶片（阿斯利康制药有限公司，批号：02002750）。黄芪建中汤（饴糖30 g、大枣6枚、生姜9 g、炙甘草6 g、桂枝9 g、芍药18 g、黄芪22 g）；小承气汤（大黄12 g、厚朴6 g、枳实9 g），全部中药均来自湖南中医药大学第一附属医院。药物经湖南中医药大学第一附属医院龙红萍副研究员进行鉴定，均符合《中华人民共和国药典》要求。中药汤液制备法：将上述药材使用蒸馏水浸泡30 min后，再煎煮2次，混合后趁热过滤，最后对药液进行浓缩（每1 mL药液含1 g生药），低温存放。

1.3主要试剂

HGF抗体（英国Abcam公司，批号：ab134152);c-Met抗体、ERK1/2抗体（美国affinity公司，批号：25869-1-AP);TNF-α、IL-1β、IL-6试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号分别为CSB-E11987r、CSB-E08055r、CSB-E04640r);PI3K抗体（美国CST公司，批号：4249);p-AKT抗体、AKT抗体（美国Proteintech公司，批号分别为66444-1-Ig、10176-2-AP);EGFR抗体（英国abcam公司，批号：ab52894）；琼脂糖（西班牙BIOWEST公司，批号：111860）。

1.4主要仪器

光学显微镜（Motic仪器公司，型号：B10T）；酶标仪（深圳市汇松科技发展有限公司，型号：MB-530）；水平琼脂糖电泳槽（中国北京六一公司，型号：DY CP-31DN）；精密pH计（中国雷磁公司，型号：PHS-3C）；切片刀（莱卡公司，型号：M199）；电热恒温培养箱（北京市永光明医疗仪器有限公司，型号：DHP-500）。

2、方法

2.1分组

将实验大鼠随机分成正常组、模型组、中药组和西药组。每组15只。

2.2造模

据参考文献[12]复制模型，对大鼠适应性喂养7 d后，先以小承气汤隔日灌胃1次，灌胃当天不喂食，次日不限饮食，共10 d。于第11日时，禁食但允许自由饮水24 h后，用耗气破气法+饥饱失常法+冰醋酸法建立GU大鼠模型，即将大鼠用戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉处理后固定在鼠板上，在无菌操作下，从左肋下纵行切开腹壁，轻拉出全胃，把一根塑料管（直径约6 mm）垂直放在胃前壁浆膜面与窦体交汇处，倒入冰醋酸灼烧胃1 min，使用适量生理盐水轻轻擦拭后，还纳胃至腹腔，缝合伤口，同时涂红霉素眼膏抗感染。造模成功的标准[13]：胃黏膜损伤指数升高、胃黏膜绒毛间有明显的出血发生，伴有黏液细胞严重脱落。

2.3给药

中药组灌以黄芪建中汤10 m L/（kg·d），即6.8 g/（kg·d），剂量根据人类剂量33 g/d以及人和大鼠体表面积换算；西药组灌以奥美拉唑10 m L/（kg·d），即4.2 mg/（kg·d），剂量根据人类40 mg/d以及人和大鼠体表面积换算。另外两组则灌以等体积蒸馏水。用10 m L/kg的体积喂各组大鼠，1次/d，共持续药物干预20 d。

2.4标本采集

结束药物干预后，每组大鼠禁食但准许摄水24 h。首先麻醉各组大鼠，从腹主动脉收集到血以后，逐层剪开腹腔，取胃剪开，去除内容物后将其清洗干净，胃组织一半采取多聚甲醛固定，另一半直接存放到-80℃冰箱。

2.5指标检测

2.5.1一般状态观察及体质量变化

观察各组大鼠的活动度、精神状态、粪便状况等一般状态，同时记录大鼠体质量的增长情况。

2.5.2胃溃疡指数（ulcel index,UI）的计算

应用10倍放大镜观察记录溃疡灶的大小，同时采取Guth[14]标准以计算胃UI。具体算法：（1）黏膜出现斑点或者糜烂，1分；（2）黏膜糜烂长度<1 mm,1分；（3）黏膜损伤长度达l～2 mm,3分；（4）黏膜损伤长度达2～3 mm,4分；（5）损伤长度>4 mm,5分。损伤的宽度>2 mm，总评分加倍。由两人同时完成评估，UI取二人计算结果的平均值。

2.5.3 HE染色检测胃组织病理变化

胃组织通过脱水、石蜡包埋、切成大小约4μm的切片，再采用HE染色常规方法规范进行，在显微镜下观察。

2.5.4 ELISA检测血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平

将收集到的腹主动脉血放在室温下待其凝固，再以3 500 r/min离心20 min，离心半径为5.5 cm，获得上清液，对应ELISA试剂盒说明书仔细操作检测炎症介质的含量。

2.5.5免疫组织化学检测胃组织HGF、c-Met蛋白表达水平

取各组的胃组织，经石蜡包埋、切片、二甲苯脱蜡、脱水，再进行热修复抗原，然后漂洗3次后封闭。先滴加稀释后的一抗（HGF、c-Met抗体稀释比例均为1∶50),4℃条件下处理过夜。冲洗3次后加入二抗（100μL左右）。经DAB显色后，将细胞核复染苏木素、返蓝、脱水，再封片处理，采取显微镜收集图像并分析。

2.5.6 RT-PCR检测胃组织HGF、c-Met、PI3K和EGFR的m RNA表达水平

取每组约0.02 g的胃组织，采用Trizol提取出总RNA，再用逆转录试剂盒合成产物cDNA。扩增条件：预变性：95℃30 s；循环反应：95℃10 s,60℃30 s，循环40次；熔解曲线：95℃15 s,60℃60 s,95℃15 s。根据2-△△Ct法计算目标m RNA的相对表达量。引物序列（由上海生工合成）见表1。

2.5.7 Western blot检测胃组织PI3K、p-AKT、EGFR的蛋白表达水平

取适量胃组织，向其中加入RIPA裂解液并反复研磨至组织溶解，离心后获取上清液。SDS-PAGE变性电泳将蛋白按分子量大小分开，完成蛋白转膜，再采取封闭液把膜封闭。然后滴加稀释后的一抗（PI3K、AKT、p-AKT、EGFR、β-actin分别以1∶1 000、1∶1 000、1∶15 000、1∶2 000、1∶5 000稀释），孵育过后进行封闭，孵育二抗之后再次进行显色。经化学发光成像系统收集图像，借助Quantity one软件算出灰度值。

2.6统计学分析

本研究的全部数据的分析均应用SPSS 22.0统计软件。计量资料采取表示。符合正态性分布和方差齐性，多组间的比较则采用单因素方差分析，若符合正态性分布但不符合方差齐性，则选用LSD法，若不符合正态性分布和方差齐性，则采用秩和检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1黄芪建中汤对模型大鼠一般情况及体质量增长情况的影响

正常组大鼠的精神状态和活动程度从造模到取材前情况均良好，毛发正常，粪便成形，同时体质量进行性增加；与正常组比，模型组大鼠精神状态较差，反应不灵敏，毛发稀疏且萎黄，粪便不成形，体质量增长率明显降低（P<0.05）；与模型组比，中药组和西药组精神欠佳、毛发稀疏、稀便、反应迟钝等情况均改善，体质量增长速度也有所加快（P<0.05）；两组之间差异无统计学意义（P>0.05）。详见表2。

3.2黄芪建中汤对模型大鼠UI的影响

相比正常组，模型组大鼠的UI明显升高（P<0.05）；中药组UI较模型组下降（P<0.05）。详见表3。

3.3各组大鼠胃组织形态的观察

正常组大鼠胃黏膜上皮组织的形态完整，单层柱状细胞相互之间排列规整，没有出血或脱落；与正常组比，模型组大鼠胃黏膜绒毛间有明显的出血发生，伴有黏液细胞严重脱皮。与模型组相比，中药组和西药组的黏膜损伤程度均有明显的改善；中药组与西药组比较差异无统计学意义（P>0.05）。详见图1。

3.4黄芪建中汤对模型大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量的影响

与正常组比较，模型组TNF-α、IL-6及IL-1β显著升高（P<0.05）；与模型组比，中药组与西药组TNF-α、IL-6及IL-1β显著下降（P<0.05）;中药组与西药组比较差异无统计学意义。详见表4。

3.5黄芪建中汤对模型大鼠胃组织中HGF、c-Met的蛋白表达水平的影响

与正常组比较，模型组胃HGF蛋白表达显著升高（P<0.05）；与模型组比较，中药组和西药组的HGF蛋白表达明显增加（P<0.05）；中药组与西药组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；各组间c-Met水平无明显差异（P>0.05）。详见表5和图2—3。

3.6黄芪建中汤对模型大鼠HGF、c-Met、PI3K、AKT和EGFR的mRNA表达水平的影响

与正常组比较，模型组胃HGF、c-Met mRNA表达水平显著上升（P<0.05),PI3K、EGFR mRNA表达水平显著下降（P<0.05）；与模型组比较，中药组和西药组胃HGF、c-Met、PI3K和EGFR mRNA表达水平均上升（P<0.05），且中药组与西药组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；各组间AKT mRNA水平无明显差异（P>0.05）。详见表6。

3.7黄芪建中汤对模型大鼠胃组织PI3K、p-AKT和EGFR蛋白表达水平的影响

与正常组比，模型组胃PI3K、p-AKT和EGFR蛋白表达明显降低（P<0.05）；与模型组比，中药组和西药组胃PI3K、p-AKT和EGFR蛋白表达明显上升（P<0.05）；中药组与西药组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。详见表7、图4。

4、讨论

GU是一种以胃黏膜深度坏死性缺损为主要病理表现的消化疾病。确切的发病机制不明，可能与幽门螺杆菌感染、胃酸分泌过多、黏膜修复功能下降、非甾体抗炎药等造成黏膜损伤有关[15]。目前，西医主要治疗药物有抗酸药、质子泵抑制剂、胃黏膜保护剂等，但都存在不良反应等缺陷。近年研究中，中医药治疗GU优势显著[16]。中医学认为GU属于“胃脘痛”“痞满”等疾病范畴，脾胃虚寒证为其常见证型之一。寒邪侵犯胃脘致气血失养、阳气受损，不荣则痛。黄芪建中汤具有温脾暖胃、补中益气及止痛的功效，可针对脾胃虚寒之病机改善胃部痛证。方中黄芪补气升阳，饴糖健脾，共为君药；桂枝驱风寒，白芍止痛，共为臣药；生姜温中散寒，大枣补血，同为佐药；炙甘草解中焦脾胃之痛，调和诸药，为使药。现代药理学研究证实[17,18]，黄芪、甘草具有保护胃黏膜的作用，桂枝、芍药具有抑制胃酸分泌的作用。本实验中GU模型大鼠在给予黄芪建中汤灌胃之后，其一般状态好转，体质量增长速度加快，UI降低，胃组织病理改变改善，表明黄芪建中汤对GU大鼠胃黏膜损伤具有一定的修复作用。

最新研究表明[19]，胃黏膜上皮细胞增殖与凋亡失衡在GU的发生发展中起关键作用。正常状态下，胃黏膜上皮细胞的凋亡与增殖保持平衡。而炎性介质、胃酸、幽门螺杆菌感染等各类刺激因素均可加速细胞凋亡，损害增殖和凋亡的平衡，进而引起胃黏膜损伤、GU发生[20]。HGF/c-Met、PI3K/AKT信号途径被抑制是诱发GU发病的两条重要信号通路[21]。HGF属于一种多效能的生长因子，其与受体c-Met结合后，能激活PI3K/AKT通路促进上皮细胞增殖、迁移、再上皮化和胃腺重建[22]。PI3K属于一种脂质激酶，其激活后能磷酸化AKT，使其具有活性，且动物实验表明，激活PI3K/AKT途径能发挥促进胃上皮细胞增殖、抑制凋亡的作用[23,24]。EGFR是一种跨膜糖蛋白，可与EGF结合构成二聚体，发挥减少胃酸分泌、促进胃溃疡愈合、修复黏膜损伤的生物功能[25]。本实验结果也显示，模型组大鼠胃组织HGF、c-Met m RNA及HGF蛋白表达显著升高，PI3K m RNA及PI3K、p-AKT、EGFR蛋白表达水平显著降低；而经黄芪建中汤干预后HGF、c-Met、PI3K m RNA及HGF、PI3K、p-AKT、EGFR蛋白表达水平显著高于模型组；但各组间c-Met蛋白表达水平差异无统计学意义。以上表明黄芪建中汤对GU胃上皮细胞增殖有明显的促进作用。修复GU黏膜损伤。

炎症亦是GU发病机制中的关键因素，且多种炎症细胞因子参与其中[26]。正常情况下，巨噬细胞应答炎症信号处在较低水平。研究发现[27,28,29]，在有害因素刺激下，巨噬细胞功能发生改变，分泌促炎因子TNF-α;TNF-α可进一步促进IL-1β、IL-6等其他促炎因子的产生，直接引起胃黏膜损伤，亦可促进中性粒细胞聚集在炎症部位，从而分解连接蛋白、破坏黏膜屏障，诱发或加重GU。本次研究发现，经黄芪建中汤灌胃给药后，GU大鼠血清中IL-6、IL-β、TNF-α含量显著降低，提示黄芪建中汤能有效抑制GU大鼠炎症反应。

综上所述，黄芪建中汤能有效改善GU大鼠胃黏膜损伤，其机制可能与激活HGF/c-Met、PI3K/AKT信号途径以促进胃上皮细胞增殖及减轻炎症反应有关。本研究为临床防治GU提供新的思路与靶点，但黄芪建中汤治疗GU的分子机制仍需进一步探索。

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文章来源:周赛男;刘琴;周姝;韩运宗;陈思清;符佳.黄芪建中汤对脾胃虚寒证胃溃疡大鼠胃黏膜保护作用的机制研究[J].湖南中医药大学学报,2023,43(11):1978-1985.