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淋球菌经NLRP3途径调节小鼠脾细胞Th17/Treg平衡

2020-10-19 786 上传者：管理员

摘要：目的研究NLRP3对小鼠脾细胞淋球菌感染模型中Th17/Treg平衡的调节作用。方法体外分离、培养小鼠脾细胞后,分为如下4组:空白对照组、NLRP3拮抗剂(MCC950)组、淋球菌感染组、淋球菌+MCC950组。培养48h后收集细胞,采用细胞内染色流式细胞术检测Th17/Treg细胞比例,利用实时荧光定量PCR检测NLRP3、Th17/Treg特异性转录因子RORγt、Foxp3mRNA表达水平,Westernblot检测NLRP3、RORγt、Foxp3蛋白表达。ELISA法检测脾细胞培养上清中Th17/Treg相关细胞因子IL-17、TGF-β、IL-10水平。结果脾细胞在淋球菌的刺激下,Th17细胞和Treg细胞比例增多,细胞内NLRP3、Th17/Treg特异性转录因子RORγt、Foxp3mRNA和蛋白表达水平升高,细胞培养上清中IL-17、TGF-β、IL-10含量增高(P<0.01);加入MCC950预处理后,Th17细胞比例、细胞内NLRP3、RORγtmRNA和蛋白表达、细胞培养上清中IL-17含量明显降低,Treg细胞比例、细胞内Foxp3mRNA和蛋白表达、细胞培养上清中TGF-β、IL-10含量明显增高,与淋球菌感染组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论淋球菌通过NLRP3途径诱导小鼠脾细胞向Th17细胞分化,调节Th17/Treg细胞平衡。

关键词：
NLRP3
Th17
Treg
性传播疾病
淋球菌
细胞平衡
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淋病通常表现为淋病奈瑟菌引起的急性化脓性生殖道感染,以大量的中性粒细胞活化渗出为特征。尽管淋病可出现明显的炎症反应,但不会引起机体对感染复发的保护性免疫[1]。笔者前期实验发现淋球菌刺激小鼠脾细胞对Th1、Th2细胞亚群无明显影响[2]。淋球菌通过活化NLRP3炎性体引起IL-1β等促炎细胞因子的分泌[3]。NLRP3炎性体介导的IL-1β的表达导致Th17/Treg失衡,诱导T细胞向Th17分化[4]。Th17细胞及其分泌的细胞因子IL-17在机体抵抗淋球菌感染免疫反应中发挥重要作用[5]。淋球菌感染诱导小鼠阴道黏膜局部产生的调节性T细胞(Treg)与淋球菌的免疫逃避机制有关[6]。笔者推测淋球菌通过NLRP3炎性体途径调节Th17/Treg平衡。本实验建立小鼠脾细胞淋球菌感染模型,观察NLRP3特异性拮抗剂MCC950对Th17/Treg平衡的影响,为防治淋球菌感染提供科学的理论基础。

1、材料和方法

1.1主要试剂

RPMIl640培养基(Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程公司),淋巴细胞分离液(达科为生物技术有限公司),MCC950(Selleck),Trizol(invitrogen),逆转录试剂盒(TOYOBO),SYBRPremixExTaqTM试剂盒(Takara),anti-NLRP3抗体(Abcam),anti-RORγt单抗(Santa),anti-Foxp3单抗(Santa),IL-17、TGF-β、IL-10ELISA试剂盒(Abcam)。CD4-FITC、CD25-APC、抗IL-17-PE、抗Foxp3-PE抗体(Ebioscience)。

1.2菌株

淋球菌ATCC49226标准株由中国药品生物制品检定所提供。菌株经淋球菌培养基培养,并制备成OD600值为0.15的细菌悬液。

1.3脾细胞体外培养及处理

雄性BALB/c小鼠,6～8周龄,体质量18～20g,购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。2%戊巴比妥麻醉小鼠,无菌取脾脏,匀浆分离脾细胞,淋巴细胞分离液分离出脾淋巴细胞,RPMI1640培养液调整浓度至2×106/mL。在24孔板中每孔加入1mL脾淋巴细胞悬液,37℃、5%CO2培养24h后更换培养基,细胞分为4个实验组:①空白对照组:用含10%胎牛血清的RPMIl640培养基常规培养48h;②NLRP3拮抗剂(MCC950)组:预先用0.1μmol/LMCC950作用细胞30min,再常规培养48h;③淋球菌感染组:加入2×107CFU/mL淋球菌悬液作用48h;④淋球菌+MCC950组:预先用0.1μmol/LMCC950作用细胞30min,再加入2×107CFU/mL的淋球菌悬液作用48h。

1.4流式细胞术检测Th17细胞和Treg细胞的比例

将每组脾淋巴细胞悬液分为4管,一管用于检测Th17细胞,一管用于检测Treg细胞,另两管分别为相应同型对照。分别加入CD4-FITC、CD25-APC、抗IL-17-PE、抗Foxp3-PE抗体进行染色后,应用流式细胞仪检测Th17细胞和Treg细胞的比例。

1.5实时荧光定量PCR检测细胞中NLRP3、Th17/Treg特异性转录因子RORγt、Foxp3mRNA表达

用Trizol试剂提取细胞总RNA,取1μg总RNA用于逆转录,逆转录按照逆转录酶试剂说明操作。RT-PCR所用引物序列如下:NLRP3上游:5′-AAGCAGCAGATGGAGACTGGAAA-3′,下游:5′-TGAACAGAGCCCTGGCAGGTAG-3′,扩增产物为149bp;RORγt上游:5′-TTTGGAACTGGCTTTCCATC-3′,下游:5′-AAGATCTGCAGCTTTTCCACA-3′,扩增产物为123bp;Foxp3上游:5′-CCCAGGAAAGACAGCAACCTT-3′,下游:5′-TTCTCACAACCAGGCCACTTG-3′,扩增产物为89bp;内参β-actin:上游5′-TTCCTTCTTGGGTATGGAAT-3′,下游:5′-GAGCAATGATCTTGATCTTC-3′,扩增产物为203bp。

1.6Westernblot检测NLRP3、RORγt、Foxp3蛋白表达水平

提取培养细胞的总蛋白,测定样品蛋白浓度。取各组不同组分蛋白样品60μg,经10%SDS-PAGE电泳分离后电转移膜,加入稀释后的一抗37℃孵育1h,洗膜后加入稀释的特异性二抗及SP-HRP37℃孵育2h,洗膜后用0.05%DAB缓冲液避光显色。

1.7ELISA法检测细胞培养上清中Th17/Treg相关细胞因子IL-17、TGF-β、IL-10含量

按照试剂盒说明书进行操作,实验完成后用酶标仪在450nm处测定吸光度值,根据制作的标准曲线计算出各组样品的IL-17、TGF-β、IL-10含量。

1.8统计学分析

计量资料以x¯±s表示,进行单因素方差分析(ANOVA),各组间的比较采用LSD法。应用SPSS19.0软件进行统计。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1脾脏Th17细胞和Treg细胞比例的变化

流式细胞术结果显示,各组间差异有统计学意义(F=135.75,152.01,F0.01=4.57;P均<0.01)。与空白对照组比较,淋球菌感染组脾脏Th17细胞和CD+4CD+25Foxp3+Treg细胞比例升高。加入NLRP3拮抗剂(MCC950)预处理后,脾脏Th17细胞比例下调,CD+4CD+25Foxp3+Treg细胞比例上调,见图1。

图1脾细胞中Th17细胞和Treg细胞比例

2.2细胞内NLRP3、Th17/Treg特异性转录因子RORγt、Foxp3mRNA表达的变化

RT-PCR结果显示,各组间差异有统计学意义(F=138.74,274.07,112.95,F0.01=4.57;P均<0.01)。淋球菌刺激小鼠脾细胞后,细胞内NLRP3、RORγt、Foxp3mRNA表达较空白对照组明显增加,分别为空白对照组的5.42倍(t=10.55,t0.01=2.98;P<0.01)、6.05倍(t=12.05,t0.01=2.98;P<0.01)和2.68倍(t=8.52,t0.01=2.98;P<0.01)。加入NLRP3拮抗剂(MCC950)预处理后,细胞内NLRP3、RORγtmRNA表达水平明显降低,细胞内Foxp3mRNA表达水平明显增高,与淋球菌感染组比较差异有统计学意义(t=11.86,8.35,12.94,t0.01=2.98;P均<0.01),见图2。

2.3细胞内NLRP3、RORγt、Foxp3蛋白表达的变化

Westernblot结果显示,NLRP3、RORγt、Foxp3蛋白各组间差异有统计学意义(F=136.29,138.18,126.37,F0.01=4.57;P均<0.01)。淋球菌刺激小鼠脾细胞后,细胞内NLRP3、RORγt、Foxp3蛋白表达较对照组明显增加,分别为对照组的5.57倍(t=11.40,t0.01=2.98;P<0.01)、5.84倍(t=12.57,t0.01=2.98;P<0.01)和2.79(t=8.84,t0.01=2.98;P<0.01)倍。加入NLRP3拮抗剂(MCC950)预处理后,细胞内NLRP3、RORγt蛋白表达水平明显降低,细胞内Foxp3蛋白表达水平明显增高,与淋球菌感染组比较差异有统计学意义(t=12.17,9.74,13.53,t0.01=2.98,P均<0.01),见图3～4。

图2细胞内NLRP3、RORγt、Foxp3mRNA荧光定量PCR结果

图3细胞内NLRP3、RORγt、Foxp3蛋白免疫印迹结果

图4细胞内NLRP3、RORγt、Foxp3蛋白免疫印迹统计结果

2.4培养上清中Th17/Treg相关细胞因子IL-17、TGF-β、IL-10含量的变化

ELISA结果表明,细胞培养上清中IL-17、TGF-β、IL-10水平各组间差异有统计学意义(F=258.37,169.84,194.38,F0.01=4.57;P均<0.01)。淋球菌刺激小鼠脾细胞后,细胞培养上清中IL-17、TGF-β、IL-10含量明显增加,与空白对照组比较,差异有统计学意义(t=14.28,11.06,12.83,t0.01=2.98;P均<0.01)。加入NLRP3拮抗剂(MCC950)预处理后,细胞培养上清中IL-17水平明显降低,TGF-β、IL-10水平明显增高,与淋球菌感染组比较差异有统计学意义(t=9.52,12.06,11.72,t0.01=2.98;P均<0.01),见表1。

3、讨论

众所周知,淋病可以反复感染,且机体不能从既往的感染中获得有效的保护性免疫。淋病症状性感染以脓性分泌物为特征,但宿主免疫反应机制尚不清楚。NLRP3炎性体是由核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族成员NLRP3、接头蛋白ASC和效应蛋白Caspase-1组成的一种分子量约为700kD的大分子多蛋白复合体,在细胞质内发挥外源性微生物或内源性危险信号感受器的作用,是活化半胱天冬酶-1(caspase-1)的分子平台,调控IL-1β、IL-18、IL-33等炎症细胞因子的成熟和分泌,在天然免疫和获得性免疫中发挥重要作用[7]。研究发现,NLRP3炎性体介导的IL-1β的表达导致Th17/Treg失衡,诱导T细胞向Th17分化,引起局部炎症反应和组织损伤[4]。

表1培养上清中细胞因子IL-17、TGF-β、IL-10含量的变化

本实验发现,淋球菌刺激小鼠脾细胞后Th17细胞、Treg细胞比例升高,NLRP3、Th17/Treg特异性转录因子RORγt、Foxp3mRNA和蛋白表达增加,细胞培养上清中Th17/Treg相关细胞因子IL-17、TGF-β、IL-10水平亦增加。这一结果表明在淋球菌感染小鼠脾细胞的体外模型中淋球菌可诱导NLRP3炎性体表达,促进Th17、Treg细胞分化和免疫反应。预先加入NLRP3特异性拮抗剂(MCC950)干预后,淋球菌刺激的Th17细胞比例、NLRP3和Th17特异性转录因子RORγtmRNA和蛋白表达水平、Th17相关细胞因子IL-17水平明显降低,Treg细胞比例、Treg特异性转录因子Foxp3mRNA和蛋白表达水平、Treg相关细胞因子TGF-β、IL-10水平明显增加。利用NLRP3特异性拮抗剂阻断NLRP3炎性体可引起Th17细胞比例降低,Treg细胞比例升高,说明淋球菌通过NLRP3炎性体途径诱导小鼠脾细胞向Th17细胞分化,调节Th17/Treg细胞平衡。

Th17细胞和Treg细胞分别在促进免疫应答和抑制免疫方面发挥关键作用[8]。在阴道淋球菌感染的小鼠模型中,淋球菌引起Th17免疫反应,活化和募集中性粒细胞向炎症部位迁移,诱发炎症反应[5]。同时,淋球菌通过调节性T细胞(Treg)的机制,抑制Th1和Th2细胞介导的适应性免疫,包括特异性抗体反应[9]。淋球菌是一种适应性很强的病原体,它能从宿主的固有免疫反应中获得生存能力,并同时抑制适应性免疫[10]。本实验通过探讨淋球菌经NLRP3途径对Th17/Treg细胞平衡的影响,有利于理解淋球菌感染免疫机制,为开发新的治疗方法及疫苗提供新思路。NLRP3炎性体可能成为新的潜在抗炎药物靶点,通过干预NLRP3炎症体的活化,调节机体抗淋球菌感染免疫状态,从而促进疾病治愈。

许莉,陈娜.淋球菌经NLRP3途径调节小鼠脾细胞Th17/Treg平衡[J].中国皮肤性病学杂志,2020,34(10):1116-1120.

基金:武汉市卫生健康委科研项目(WX15B13,WX19D28).