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原发性肾病综合征患儿PHB水平与SRNS的相关性研究

2020-07-15 223 上传者：管理员

摘要：目的：通过检测原发性肾病综合征（PNS）患儿血清抗增殖蛋白（PHB）水平，探讨其与激素耐药型肾病综合征（SRNS）的相关性，阐明PNS激素耐药的可能机制。方法：选取PNS患儿72例作为研究对象，分为29例SRNS及43例激素敏感型肾病综合征（SSNS）两组，以正常体检儿童60例作为对照组，应用Western Blot检测并比较其抗PHB水平。结果：对照组血清中PHB为阴性，SSNS组与SRNS组治疗前的抗PHB水平均高于对照组（P<0.000);SRNS组、SSNS组治疗前血清抗PHB水平比较，两组治疗前差异无统计学意义（P>0.05),SSNS组治疗后血清抗PHB水平明显低于治疗前（P<0.05),SRNS治疗后血清抗PHB水平与治疗前无明显差异（P>0.05）。结论：SRNS患儿血清PHB水平增高，提示其可能参与SRNS的激素耐药的发生发展过程。

关键词：
儿童
抗增殖蛋白
泌尿系统
激素耐药型原发性肾病综合征
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原发性肾病综合征是因肾小球滤过膜通透性升高，导致血浆内大量蛋白质从尿丢失的一种临床综合征。以大量蛋白尿、明显水肿、低蛋白血症、高胆固醇血症为主要临床表现[1]。PNS是小儿肾脏常见的疾病，缺乏特效治疗手段，激素仍是目前治疗PNS的重要方法[2]。根据对激素治疗4周反应，分为激素敏感型肾病综合征和激素耐药型肾病综合征，其中大部分SSNS患儿在接受大于4周的激素治疗后，病情能够得到及时有效的控制，而SRNS不仅对糖皮质激素耐药，还可对多种免疫抑制剂耐药，病情易复发或迁延，其预后差[3]。30%～40%SRNS患儿在发病10年后逐渐进展至终末期肾病。因此研究PNS激素耐药发生机制对SRNS的诊疗有重大意义。Guo等[4]首次报道在正常肾脏组织中可表达抗增殖蛋白（PHB）基因，其可能与肾间质纤维化（RIF）发生发展过程有关。PHB主要存在于肾小管和间质细胞中，且与肾小管间质损伤程度关系明显，与肾小管间质损伤有明显负相关性。PHB是一种近年发现的蛋白质，主要存在于细胞膜、线粒体内膜及细胞核，具有明显抑制细胞增殖的作用[5]。史雨等[6]研究发现PNS患儿血PHB明显增高，并与肾小球及肾小管间质损伤程度明显相关。然而，PHB是否参与了PNS激素耐药机制，国内外鲜有报道。本研究旨在探讨PHB与PNS激素耐药的相关性及其可能机制，为临床防治难治性PNS提供理论依据。

1、对象与方法

1.1研究对象

收集2014年1月至2017年12月在广西医科大学第一附属医院儿科治疗的PNS患儿72例作为研究对象，所有研究对象诊断均符合2001年中华医学会儿科学分会肾脏学组制定的小儿肾小球疾病的临床分类和诊断标准[7]。根据对激素治疗反应又分SRNS和SSNS,SSNS为泼尼松2mg/kg·d治疗4周内蛋白转阴者，SRNS为泼尼松2mg/kg·d治疗>4周尿蛋白仍呈阳性者[8]。对照组为健康体检儿童，病例纳入标准为：（1）年龄≤18岁；（2）无心、肝、肾功能损害，无高血压、糖尿病及泌尿系统疾病；（3）尿常规检查无异常；（4）无原发性及继发性肾脏疾病，既往无肾病史。具体分组如下：PNS组72例，其中男35例，女37例，平均（6.60±5.38）岁；根据泼尼松治疗效果，4周后评估，尿蛋白转阴的患儿为SSNS组，共43例，其中男19例，女24例，年龄1～8岁，平均（4.90±3.26）岁；尿蛋白仍呈阳性的患儿为SRNS组，共29例，其中男16例，女3例，年龄2～9岁，平均（6.30±3.48）岁，其中12例行肾穿病理检查。对照组60例中男28例，女32例，年龄1～8岁，平均(4.50±3.46)岁。本研究已取得医院伦理委员会同意审批，所有研究对象监护人均已签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本收集和处理

PNS组于GC治疗前及治疗后4周分别采集清晨空腹外周静脉血2.0mL,1500r/min离心5min后取上清液，并于-20℃冰箱保存待测。同时应用酶学测定法检测24h尿蛋白、血清白蛋白、血清胆固醇水平，均达到肾病综合征诊断标准。待治疗4周后，PNS组分为SSNS组以及SRNS组。对照组血和尿液标本收集及检测项目、方法同上。

1.2.2Westernblot检测

应用Westernblot检测各组血清中抗增殖蛋白水平。其中一抗为小鼠抗人PHB单克隆抗体，浓度为1∶500；二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体，浓度1∶2000。内参照为小鼠肝组织抗体增殖蛋白的表达。

1.3统计学方法

采用SPSS17.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间样本均数比较，若方差齐，采用t检验；若方差不齐，采用秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.172例PNS患儿治疗4周后，根据对激素敏感性

分为两组，SSNS组43例，SRNS组29例。Westernblot检测见图1。

图1对照组，SSNS组及SRNS组治疗前、后PHB水平

2.2各组抗PHB水平比较

对照组血清中抗PHB为阴性；SSNS组及SRNS组抗PHB水平显著高于对照组（P<0.000），见表1。

表1各组抗PHB水平

2.3SRNS组和SSNS组治疗前血清抗PHB水平比较

两组血清PHB水平比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2SRNS组和SSNS组治疗前血清抗PHB水平比较

2.4SSNS组和SRNS组治疗前、后血清抗PHB水平比较

SSNS组治疗后血清抗PHB水平明显低于治疗前（P<0.05),SRNS治疗后血清抗PHB水平与治疗前比较，差异无统计学意义（P>0.05)，见表3。

表3SSNS组和SRNS组治疗前、后血清抗PHB水平比较

2.5病理组织学检查

12例SRNS患儿肾脏病理结果如下：系膜增生性肾小球肾炎5例，局灶节段性肾小球硬化2例，轻微病变3例，微小病变1例，膜性肾病1例。

3、讨论

PHB具有多种生物学功能，可通过调控细胞周期来抗增殖和诱导细胞凋亡，参与细胞生存和保护细胞免受氧化应激损伤，维持线粒体的结构与功能等[8]。

研究发现，血液循环中可能存在PHB蛋白，PHB蛋白水平增高可能与PHB抗细胞增殖有关[9]。其抗增殖的机制可能为：（1）细胞核上的PHB基因通过抑制E2F的转录活性从而抑制细胞增殖，进而调控细胞周期[10,11]；另外，线粒体内膜上的PHB可发挥分子伴侣的作用，稳定线粒体蛋白的完整性和能量代谢[12]。研究发现，PHB与线粒体内膜的ATP依赖蛋白酶及mAAA蛋白酶参与调节膜蛋白正确折叠，进而在线粒体功能中发挥重要作用[13]。（2)PHB蛋白可增强p53与DNA启动子的结合能力，起到抑制细胞增殖的目的[11]。Rajalingam等[14]发现，PHB缺乏将抑制细胞分化与增生。

本研究发现，健康对照儿童血中PHB蛋白检测阴性，说明健康机体血液中无PHB表达抑或仅存极微量PHB以致于Westernblot不能检测出，而在SSNS组和SRNS组中PHB均显著增高，提示PHB参与肾脏疾病发生发展的某些过程，与史雨等[6]的研究发现一致。笔者推测PNS患儿PHB升高原因：因体内实验表明PHB主要存在于肾小管和肾间质细胞，与肾小管间质损害相关；而PNS虽为肾小球疾病，但大量蛋白尿排出，导致肾小管重吸收增加，亦会致肾小管损伤，有可能反应性导致PHB增高。Guo等[4]首次报道了PHB可能参与RIF的发生发展过程。PHB蛋白表达与肾间质纤维化指数呈显著负相关，其表达量随着肾间质损伤程度的加重而降低，提示PHB可能与RIF的发生发展密切相关。而史雨等[6]的研究血PHB水平与肾小管间质损伤呈明显正相关,两者不一致原因，推测如下，Mishra等[5]的研究发现了血循环中的PHB蛋白能与补体C3结合,诱导其构象改变并改变C3活性,因此血PHB升高也可能与其免疫调节作用相关。体外研究提示PHB可显著抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞的增生活化和长成ECM。而TGF-β1是纤维化进程的中心环节，其蛋白表达与肾间质纤维化指数呈显著正相关，可促进ECM的沉积，是RIF进展的重要介导因子之一[15,16]。本课题组赵艳君等[17]研究发现，在单侧输尿管结扎所致RIF大鼠肾脏组织中，梗阻时间越长，PHB表达率越低，RIF的程度越重，其PHB蛋白及mRNA的表达也均显著降低，提示PHB可能参与RIF的发生发展过程。由此提示，PHB可能作为肾脏病进展的重要调节因子之一，并能反映肾小管间质损伤程度。本组研究发现，治疗前SRNS组的PHB水平与SSNS组差异不大，原因可能是SRNS及SSNS患儿起病就诊时，短时间内大量蛋白尿排出，刺激肾小管、肾间质，PHB水平增高可能与此有关，也可能与PHB免疫调节作用相关,而从PNS起病到RIF，是一个从肾小球的疾病发展到肾间质的纤维化的比较漫长的过程，不是短短的4周左右的时间就能达到的，因此我们认为治疗前和治疗4周后的SSNS及SRNS患儿血PHB水平的差异，并不能作为患儿长期预后的早期判断标准，患儿长期的PHB变化，需要进一步观察。

本研究结果中SRNS组治疗前、后PHB水平无明显变化（P>0.05），而SSNS组治疗后血PHB却降低（P<0.05）。根据史雨等[6]的研究表明肾小管间质损伤程度越重，血PHB的表达水平越高，由此推测，PHB可能参与SRNS耐药的发生发展过程，从而影响GC对SRNS治疗效果。但SRNS诱导血PHB增高的原因仍需进一步探讨。

近年来许多学者从免疫因素、脂类因素、遗传因素等方面对肾病综合征机制进行了大量的研究。Sun等[18]发现PHB能够通过JNK1信号通路募集组蛋白去乙酰化酯酶，抑制由移形促进因子及肌源性调控因子介导的基因转录，从而抑制肌细胞的分化。由此猜测，PHB是否也可以通过类似的信号通路来募集酯酶，抑制脂肪酸的合成，从而参与SRNS的激素耐药机制。有学者发现PHB可能参与肥胖症、糖尿病等疾病的发生发展过程[19]，推测PHB对脂肪酸有影响。而SRNS患儿尿蛋白持续阳性，血脂持续高值，因此SRNS患儿PHB水平与患儿高脂血症相关性，需要进一步研究。另外，免疫因素在肾病综合征的发病机制的研究中一直占有重要地位，而在血液循环中，补体C3与PHB蛋白结合，导致其自身构象改变，从而影响其活性，推测PHB可能参与免疫调节和炎症的发生发展过程。另外，有文献报道系膜细胞具有C3b受体，可以捕获带有C3b的免疫复合物，提高了系膜细胞对免疫复合物的清除。当PHB诱导C3构象改变从而改变自身的活性时，会导致系膜细胞功能减弱，使免疫复合物不能被有效清除而沉积。这可能为SRNS的发病机制提供一些研究方向。

本研究因患儿家属对肾穿病理检查接受度不高，29例SRNS患儿只有12例进行肾穿病理检查，结果以系膜增生性肾小球肾炎居多，占41.6%，据以往研究，PHB具有明显的抗增殖作用，系膜增生性肾小球肾炎存在系膜增殖，因此推测PHB在SRNS组较高，也与系膜增生性肾小球肾炎比例高有关。因本研究肾穿患儿例数过少，未能进一步就其病理情况进行分析，仍需要进一步扩大样本深入研究。

参考文献：

[3]张琰琴,丁洁,王芳,等.儿童遗传性肾脏疾病[J].北京大学学报(医学版),2013,45(2):182-185.

[6]史雨,黄文彦,徐虹,等.肾病综合征患儿血清抗增殖蛋白水平[J].临床儿科杂志,2010,28(3):264-268.

[7]倪春燕.小儿肾小球疾病的临床分类､诊断及治疗[J].医药前沿,2013(32):263-264.

[8]刘丹,陈舒华.Prohibitin与肿瘤关系的研究进展[J].实用医学杂志,2014(23):3865-3867.

[17]赵艳君,覃远汉,陈静,等.Prohibitin在单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化中的表达和作用[J].临床儿科杂志,2010,28(1):69-72.

周春,覃冰,覃远汉,赵艳君.儿童激素原发性肾病综合征抗增殖蛋白的研究[J].广西医科大学学报,2020,37(05):907-910.