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新生血管形成过程中miR-296-5p对FGF23调控作用

2024-10-29 79 上传者：管理员

摘要：目的研究miR-296-5p通过调节成纤维细胞生长因子23(FGF23)在新生血管生成过程中发挥的调控作用。方法用血管内皮生长因子（VEGF）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs），构建模拟新生血管形成的体外模型，通过RT-qPCR比较对照组与新生血管组中miR-296-5p的表达水平。通过细胞转染构建miR-296-5p高表达组、miR-296-5p低表达组以及对照组细胞，比较3组细胞的迁移和成管能力，并通过蛋白免疫印迹实验比较3组FGF23的表达水平。结果与未经处理的对照组相比，VEGF诱导的新生血管组中miR-296-5p的表达水平显著增加（P <0.001）。与对照组比较，miR-296-5p低表达组的迁移距离和成管数均降低（P <0.001和P <0.05）；而miR-296-5p高表达组的迁移距离和成管数均增加（P <0.001和P <0.01）。与对照组比较，miR-296-5p低表达组的FGF23表达水平明显降低（P <0.01）；而miR-296-5p高表达组FGF23表达水平明显升高（P <0.01）。结论 miR-296-5p可通过上调FGF23的表达促进新生血管生成。

关键词：
miR-296-5p
不良因素
人脐静脉内皮细胞
成纤维细胞生长因子23
新生血管
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角膜新生血管（CNV）是指在某些不良因素刺激下，血管内皮生长因子（VEGF）过度表达或血管生成调控机制紊乱，导致角膜缘的血管侵入角膜的一种眼表病理现象[1]。目前，针对CNV的治疗手段主要包括抗炎药物、抗VEGF药物和手术等[2]。但这些治疗策略存在局限性，譬如药物治疗常受限于非特异性及显著的副反应，单独使用时难以充分抑制血管生长；手术治疗则面临诸多可变因素，导致疗效不稳定。在此背景下，基因治疗作为一种新兴疗法崭露头角，它利用特定载体将核酸引入细胞内部，旨在精准纠正或恢复细胞功能，实现治疗目标。相较于传统疗法，基因治疗展现出优越的治疗特异性，在CNV的治疗中有广阔的应用前景。因此，寻找安全、有效的基因治疗靶点已成为CNV研究的热点[3]。

微小RNA(miRNA）是一类非编码RNA分子，普遍存在于真核细胞中，其通过碱基配对在靶基因转录后调控中发挥重要作用。miRNA具有分子量小、保守性高等特性，使用生物载体搭载miRNA类似物或拮抗剂进行基因治疗具有高效率和高特异性等优势[4]。miR-296-5p位于染色体20q13.32基因组位点，是miR-296家族的成员之一，被认为是与肿瘤血管生成相关的miRNA，在多种炎症性血管疾病及信号调控中扮演着关键的角色[5]。

成纤维细胞生长因子23(FGF23）属于成纤维细胞生长因子（FGF）家族，其主要表达于骨细胞及成骨细胞。FGF23在血管疾病中通过调控VEGF发挥了重要作用[6]，与CNV有潜在相关性[7]。然而，FGF23在CNV中的具体作用仍不清楚。基于此，本研究旨在通过体外实验探究miR-296-5p在CNV过程中对FGF23的调控作用。

1、材料与方法

1.1主要试剂与仪器

VEGF购于上海基屹生物科技有限公司；miR-296-5p mimic、miR-296-5p inhibitor、miR-296-5p NC及转染试剂购自广州锐博生物技术有限公司。

使用的主要仪器有恒温细胞培养箱（美国Thermo Scientific公司）、低温高速离心机（德国Sartorius公司）、正置光学显微镜（日本Olympus公司）、倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养和新生血管模型建立

人脐静脉内皮细胞（HUVECs）由南昌大学临床药理研究所提供。HUVECs在37℃，5%CO2恒温培养箱中培养，选取第8～15代的细胞进行实验。通过向细胞培养基中添加10 ng·mL-1的血管内皮生长因子（VEGF）后培养24 h，建立体外新生血管模型。

1.2.2细胞迁移实验

将HUVECs接种至6孔板中，待各组细胞生长至汇合度100%后，用200μL移液枪枪头在单层细胞的固定位置上划痕，随后用PBS缓冲液润洗3次。随后，用无血清培养基继续培养24 h。用倒置显微镜观察拍摄划痕区域，使用ImageJ软件测量并量化细胞迁移距离。

1.2.3细胞成管实验

将预先冷冻融化的基质胶均匀铺展于96孔板底部，确保无气泡后，置于37℃恒温培养箱中使其凝固。随后，以2000个·孔-1的密度将各组细胞接种于的基质胶表面，放回培养箱中继续培养8 h。用倒置显微镜观察细胞形成的管状网络结构，使用ImageJ软件对管状结构的数量进行统计。

1.2.4 RT-qPCR

根据试剂盒说明书，在无核酶EP管中配置逆转录反应体系，42℃水浴下反应2 min。完成后加入无核酶水、茎环引物（2µM）和逆转录产物混合物，在25℃下反应5 min、50℃下反应15 min、85℃下反应5 min。记录并分析CT值数据，用2-ΔΔCt法评估目标基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1相关引物序列

1.2.5细胞转染和分组

当细胞生长汇合度达到约70%时进行转染操作。将5μL Lipo3000试剂轻柔地加入到250μL opti-MEM培养基中，充分混匀后静置5 min。分别将10μL的miR-296-5p mimic(miR-296-5p高表达组）、10μL的miR-296-5p inhibitor(miR-296-5p低表达组）以及10μL的miR-296-5p NC（对照组）加入到另外3份250μL opti-MEM培养基中，轻柔混匀后静置20 min。将上述制备好的转染复合物混合均匀，加入到500～1500μL的无血清培养基中，制成转染混合液，分别加入各组细胞。在培养箱中孵育6 h后，更换完全培养基继续培养。

1.2.6蛋白质免疫印记

提取各组蛋白质样本并测定浓度后进行上样，并在泳道两端分别加入2μL的电泳标记物（marker）。初始阶段以75 V进行恒压电泳，至marker出现明显分离将电压上调至120 V继续电泳。电泳结束后，构建“三明治”结构的转膜装置，将蛋白转移至预先裁剪并标记的PVDF膜上。用TBST缓冲液洗膜5 min，用快速封闭液进行封闭处理，孵育1 h。用TBST缓冲液洗膜5 min，将膜浸入一抗稀释液中，置于4℃摇床上过夜震荡孵育。用TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。将膜浸入二抗稀释液中，在室温下置于摇床上孵育1 h。用TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。将膜浸入ECL发光液中，用凝胶成像系统进行曝光和成像分析。

1.3统计学方法

使用Graph Pad Prism 8.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验和单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1体外新生血管模型中miR-296-5p表达升高

RT-qPCR结果表明，与未经处理的对照组相比，VEGF诱导的新生血管组中miR-296-5p的表达水平显著增加（P<0.001）。见图1。

图1体外新生血管模型中miR-296-5p表达升高

2.2 miR-296-5p促进HUVECs迁移和成管

与对照组比较，miR-296-5p低表达组的迁移距离和成管数均明显降低（P<0.001和P<0.05）；而miR-296-5p高表达组的迁移距离和成管数均明显增加（P<0.001和P<0.01），见图2。

2.3 miR-296-5p促进FGF23蛋白表达

蛋白质免疫印记结果显示，与对照组比较，mi R-296-5p低表达组的FGF23表达水平明显降低（P<0.01）；而mi R-296-5p高表达组FGF23表达水平明显升高（P<0.01），见图3。

图2 miR-296-5p促进HUVECs迁移和成管

图3 miR-296-5p促进FGF23蛋白表达

3、讨论

贝伐单抗和曲安奈德等药物已被证实可以抑制CNV，然而，这些药物的特异性较低，会引起一定副反应[8]。因此，探索更有效的基因治疗靶点是目前CNV研究的热点之一。有研究[5]指出，miR-296-5p在多种人类疾病中呈现异常表达，通过作用于不同的靶基因，在多种病理生理过程中发挥着不同作用。例如，miR-296能够通过靶向干细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物（HGS）来抑制HUVECs的迁移和管腔形成，从而促进脑缺血后的血管生成；miR-296通过抑制p53、p21WAF1和p27促进血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖等[9]。miR-296-5p是一种具有促血管生成作用的miRNA，在本研究得体外验证了miR-296-5p对HUVECs的迁移、成管有促进作用，与之前的研究[10]结论一致。这表明miR-296-5p可能成为抗CNV基因治疗中一个有前景的靶点。

有研究[11]表明，CNV过程涉及多种复杂机制的共同调控，其中VEGF是核心作用分子之一。VEGF是血管生成和血管通透性的主要调控因子，VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PGF。VEGF在许多与血管相关的眼部疾病中高表达，在角膜以及其他眼部组织的新生血管中VEGF水平显著增加。在CNV中，VEGF-A起着主要作用[12]，阻断VEGF或其内皮细胞特异性受体可CNV的生成。此外，CNV属于炎症性疾病，多种炎症因子参与了其病理过程。炎症因子的增加进一步破坏了角膜中的免疫平衡状态，从而促进了CNV。柚皮素滴眼液、瑞香素（DAP）等药物能够通过抑制炎性细胞因子减少角膜新生血管的形成[13-14]，表明抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α）、白细胞介素-1β(IL-1β）等炎症因子是治疗CNV的有效方法。本研究结果显示，miR-296-5p升高导致FGF23表达升高。在胎盘血管生成中，FGF23通过p-ERK/EGR-1信号通路上调VEGF-A的表达[15]。另有研究[16]表明，在一些炎症类疾病中，FGF23对IL-1β等炎症因子有调控作用。提示FGF23参与了CNV，其机制可能与炎症因子升高、VEGF-A升高有关。

miRNA的通过抑制下游靶基因发挥作用[17]，提示miR-296-5p可能抑制了某种CNV相关靶基因从而间接对FGF23产生了促进作用，后续研究应寻找miR-296-5p的直接靶基因，未来有望利用新型载体携带miR-296-5p的反义核苷酸序列，开发更安全、有效的CNV治疗方法。

基金资助:江西省自然科学基金资助项目(20212ACB206022);江西省卫健委科技计划项目(202110043);

文章来源:皮怡洁,姚雯,杨秋艳,等.新生血管形成过程中miR-296-5p对FGF23的调控作用[J].南昌大学学报(医学版),2024,64(05):25-28+43.