随着我国人口增长、城市化进程加快和经济社会不断发展,污水排放总量也逐年升高。大量污水在排放前必须经过污水处理厂一系列处理,达到排放标准。细菌在污水处理中发挥着重要的作用,如变形菌门(Proteobacteria)细菌参与脱氮除磷、拟杆菌门(Bacteroidota)细菌参与有机物降解、厚壁菌门(Firmicutes)细菌参与反硝化等[1-2]。

除发挥污水处理作用的功能细菌外,污水处理厂中还包含大量病原细菌,形成病原菌的“汇”。病原细菌随感染者排泄物进入污水管道,最终汇入城市污水处理厂[3]。研究[4-6]指出,污水处理厂中存在沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、大肠杆菌和军团菌(Legionella)等多种病原细菌,感染可引发各类胃肠道和呼吸系统疾病。值得注意的是,目前已发现超过50种Legionella,其中近1/2与人类疾病有关[7]。通常情况下,经过污水处理厂处理和消毒灭活后病原菌的数量会大大降低,但部分病原菌生存能力强,难以完全去除[8],直接或间接暴露于含病原细菌的水体中可能会增加水媒传染病感染风险。Pruss等[9]统计数据显示,水媒传染病感染造成的死亡人数约占全世界总死亡人数的4%。由此可见,增强对污水处理各环节病原细菌的系统研究,明晰其群落结构和物种组成,对控制再生水中致病菌的环境排放,保障生态安全和公众健康具有重要意义。

一般来说,消毒是污水处理厂灭活病原细菌的主要手段,但是较高的病原微生物负荷会影响消毒效果。为了降低污水处理厂出水的微生物风险,避免消毒剂投加量升高对排放水体的负面影响,需要明确各工艺段对病原细菌的削减程度。目前,对污水处理厂不同工艺段病原细菌的存在状况和控制效果研究较少,为了规避病原细菌带来的公共健康风险,亟需明晰各工艺段病原细菌分布情况及对病原细菌的去除效能,这对病原细菌的控制和再生水的回用安全具有重要意义。因此,本研究通过16S r RNA测序技术分析污水处理厂夏、冬两季中细菌群落结构和优势菌群、确定潜在的病原细菌,采用实时荧光定量PCR技术(real-timequantitative polymerasechainreaction,q PCR)定量检测典型病原菌大肠杆菌和含量并利用微生物风险评估模型评估其健康分析,以期对污水处理厂中的细菌,特别是病原细菌群落结构及分布状况及风险水平进行全面解析。

1、材料与方法

1.1样品采集与预处理

本研究以中国北方某活性污泥工艺污水处理厂(工艺流程如图1所示)为研究对象,于夏(2021-08)、冬(2021-12—2022-01)两季选取原水(100m L)、曝气池出水(500m L)、二沉池出水(500m L)、超滤膜出水(3L)、臭氧消毒池出水(3L)、紫外消毒池出水(3L)及曝气池污泥(1m L)进行样品采集,每周1次,夏季连续取样4周,冬季连续取样3周,共采集49份样品。采集到的样品暂存于4℃冰箱中,24h内完成预处理和基因组DNA提取。利用真空抽滤装置和0.22μm微孔滤膜(MerckMillipore,Billerica,MA,USA)过滤水样以截留细菌。

图1 污水处理厂工艺流程

1.2基因组DNA提取

用无菌剪刀和无菌镊将滤膜剪碎,放入Lysing MatrixETube中,按照FastDNATMSpinKitforSoil(MPBiomedicals,Solon,OH,USA)试剂盒提供的说明书提取样本的基因组DNA。采用Nanodrop微量分光光度计(Thermo,USA)对DNA浓度及纯度进行测定,并置于-20℃下保存。

1.3 16S r RNA基因高通量测序及数据分析

采用引物对338F (5′-ACTCCTACGGGAGG-CAGCA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTW-TCTAAT-3′)扩增细菌16Sr RNA的V3-V4高变区。PCR体系如下:2×ProTaq10μL,上游引物(5μmol/L)0.8μL,下游引物(5μmol/L)0.8μL,TemplateDNA10ng/μL,无菌水补足至20μL。PCR条件如下:95℃预变性3min,在95℃30s,50℃30s,72℃42s下进行30个循环,最后在72℃延伸10min。PCR产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行16Sr RNA测序,测序平台为IlluminaMiseq(Illumina,USA)。

对于得到原始测序数据,首先使用Trimmomatic v0.39除去序列中的barcode,然后使用FLASH v1.2.11对短序列进行拼接以组装成长序列。使用QIIME2对拼接序列进行质量控制和后续分析,具体如下:将所得序列进行相似性分析,并划分操作分类单元(OTUs)(相似性大于0.97),随后使用Uparse7.0.1090 (http://drive5.com/uparse/)软件对Tags在97%的相似度水平下进行聚类以获得OTUs,有效序列与SILVA数据库(Release138http://www.arb-silva.de)进行对比并对OTUs进行分类学注释,分别在各个分类水平下统计各样本的群落组成与OTUs信息。参考Fang等[10]的微生物α多样性指数算法计算Chao (物种丰度)指数、Shannon(物种多样性)指数和Coverage(覆盖度)指数。基于R语言(version3.3.1)工具绘制群落结构柱状图。夏、冬两季和不同工艺段中组间差异的比较采用Kruskal-Wallis秩检验和单因素方差分析进行检验。

1.4 q PCR

根据Donohue等[11]建立的嗜肺军团菌定量检测方法,采用引物对(正向:LpneuCGGAATTACT-GGGCGTAAAGG,反向:LpneuGAGTCAACCAGT-ATTATCTGACCG)和探针(LpneuFAM-AAGCCCA-GGAATTTCACAGAT-TAMRA)。反应体系(20μL):10μLPremixExTaq(Takara,JP),0.4μL正向引物(10μmol/L),0.4μL反向引物(10μmol/L),0.4μL探针(10μmol/L),1μLDNA模板,0.4μLBSA(5mg/m L),7.4μL无菌水。反应条件如下:95℃预变性10min,在95℃10s,60℃30s,72℃1s下进行45个循环,最后在40℃下延伸30s。根据Maheux等[12]建立的大肠杆菌SYBR定量检测方法,采用引物对(正向:UALTGGTAATTACCGAC-GAAAACGGC,反向:UARACGCGTGGTTACAGTCT-TGCG)对样品中的目标细菌进行定量。反应体系(20μL)如下:10μLSYBRGreen1染料(Takara,JP),0.4μL正向引物(10μmol/L),0.4μL反向引物(10μmol/L),1μLDNA模板,0.5μL的ROX染料(50X),0.4μLBSA(5mg/m L),7.3μL无菌水。反应条件如下:95℃预变性5min,在95℃1min,62℃1min,72℃1min下进行35个循环,最后在72℃下延伸10min;q PCR扩增仪器为ABIQ1(AppliedBiosystems,Carlsbad,CA,USA)。

1.5健康风险评价

本研究按照美国环境保护署推荐的风险评价“四步法”,对污水处理厂中嗜肺军团菌和大肠杆菌的风险进行评估。较为常用的是表1中Hass等[13]提出的“指数模型”与“Beta-Poisson模型”[式(1)～式(2)],根据Semerjian等[14]假定每人意外摄入1m L/d污水。

表1 健康风险评估模型

2、结果与讨论

2.1污水处理厂细菌群落多样性分析

本研究对我国北方某污水处理厂夏、冬两季各工艺段共计49个样本进行细菌16Sr RNA基因测序,共得到2209071条优化序列,29875个OTUs。为避免测序深度的差异对分析结果产生影响,保证数据之间的可比性,将每个样品按最小序列数进行抽平,平均长度为419bp。

α多样性是特定生态系统内的多样性,Chao指数和Shannon指数分别反映群落丰富度和群落多样性[17]。由表2可知,样本覆盖率均在97%以上,表明其测序深度足够,结果可靠。夏季样本中,曝气池、二沉池和污泥中的Chao指数显著高于其他采样点,Shannon指数呈现同样趋势;而冬季样本间无显著差异,各采样位点间群落丰富度和多样性相似如图2所示。表明温度影响细菌多样性,夏季气温高,细菌生长繁殖加快,群落更迭随之增加;冬季低温条件下细菌群落结构更稳定。

2.2污水处理厂细菌群落结构分析

污水处理厂门水平细菌群落结构如图3所示,45个菌门中Proteobacteria、弯曲杆菌门(Campilobacterota)、Bacteroidota、放线菌门(Actinobacteriota)、超门(Patescibacteria)、Firmicutes和蛭弧菌门(Bdellovibrionota)占主导(占比小于1%时划入其他类别)。与其他研究结果一致,多数活性污泥处理系统中,主要的微生物种群是Proteobacteria和Bacteroidota[18-20]。Proteobacteria细菌主要参与反硝化作用且能够去除有机物[21-23],Bacteroidota细菌主要降解污水中的有机物。工艺组间差异显著性检验(Kruskal-Wallis秩和检验)结果显示,不同采样点优势菌门相对丰度存在显著差异(p<0.05)。原始污水中主要是Campilobacterota,占比在50%以上,其余样本点Proteobacteria占主导,特别是在超滤膜和紫外消毒采样点占比达70%以上。夏、冬两季对比发现,冬季Campilobacterota(p<0.05)和Firmicutes(p<0.05)相对丰度显著高于夏季,而夏季Bdellovibrionota(p<0.05)相对丰度显著高于冬季。

表2 样本α多样性ofα

图2 α多样性指数组间差异检验

在属水平上,共检出1179个菌属(占比小于1%时化入其他类别),前20个优势菌属群落结构如图4所示。主要的优势菌属有:弓形杆菌属(Arcobacter)、嗜甲基菌属(Methylophilus)、假支杆菌属(Pseudarcobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)和假单胞菌属(Pseudomonas)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、甲基娇养杆菌属(Methylotenera)。Arcobacter、Pseudarcobacter、Mycobacterium和Methylotenera在不同季节、不同工艺段中的丰度存在极显著差异(p<0.001);Methylophilus、Acinetobacter和Pseudomonas的丰度存在显著差异(p<0.05)。

2.3潜在的病原细菌

及时识别污水处理厂中的潜在病原菌对保障再生水安全和从业者健康至关重要,基于毒力因子数据(http://www.mgc.ac.cn/VFs/)[24-25]整合国内外病原菌分类研究[26-29],从所得测序数据中筛选得到病原菌类群。各个采样点中病原菌存在情况如图5所示。结果显示,污水处理厂中共检出27个含有病原体的属,包括Arcobacter、Pseudomonas、Mycobacterium、Acinetobacter、气单胞菌属(Aeromonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、Legionella、芽孢杆菌属(Bacillus)、诺曼梭状芽孢杆菌属(Cloacibacterium)、链球菌属(Streptococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、柯克斯氏体属(Coxiella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、钩端螺旋体属(Leptospira)、沙雷氏菌属(Serratia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、立克次氏体属(Rickettsia)、鲍特菌属(Bordetella)、耶尔森氏鼠疫杆菌属(Yersinia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、弧菌属(Vibrio)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、螺杆菌属(Helicobacter)和诺卡氏菌属(Nocardia)。

图3 细菌门水平相对丰度直方图/热图

图4 细菌属水平相对丰度直方图/热图

不同季节比较结果可见,夏季丰度较高的病原菌主要是Arcobacter、Pseudomonas、Mycobacterium;冬季丰度较高的病原菌主要是Arcobacter、Acinetobacter和Aeromonas。Arcobacter中的嗜低温弓形杆菌(A.cryaerophilus)、布氏弓形杆菌(A.butzleri)、斯氏弓形杆菌(A.skirrowli)感染可导致腹泻、菌血症等疾病。Pseudomonas中的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)是重要的院内感染条件致病菌,感染可引发创面感染。Mycobacterium是一类革兰氏阳性细菌,包括50多种细菌,其中结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)和溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)为环境致病菌,主要通过呼吸道传播。Aeromonas在环境中无处不在,其中嗜中性气单胞菌(A.hydrophila)可感染人类,引发胃肠炎和伤口感染。Kruskal-Wallis秩和检验结果显示,冬季样品中Acinetobacter(p=0.0003)、Aeromonas(p=0.0027)、Bacteroides(p=0.0003)、Enterococcus(p=0.0001)的相对丰度均显著高于夏季。

不同工艺段比较结果可见,进水中主要是Arcobacter。曝气池中主要是Mycobacterium、Acinetobacter和Arcobacter,Acinetobacter中的鲍曼不动杆菌(A.baumannii)是一种新型条件致病菌,主要与医院获得性感染相关,可引发肺炎、菌血症、心内膜炎、皮肤和软组织感染、尿道感染和脑膜炎。二沉池中主要是Arcobacter、Aeromonas和Mycobacterium。超滤膜处理出水后主要是Pseudomonas、Acinetobacter和Arcobacter,Pseudomonas中的P.aeruginosa是重要的院内感染条件致病菌,感染可引发创面感染。臭氧消毒池出水后,各含有病原菌属的占比相对均匀,主要是Mycobacterium、Aeromonas和Bacillus。紫外消毒池出水中,主要是Pseudomonas和Acinetobacter。污泥中主要是Mycobacterium和Arcobacter。KruskalWallis组间差异检验结果显示,再生水中Mycobacterium(p=0.00001)、Arcobacter(p=0.00008)、Aeromonas(p=0.0136)、Legionella(p=0.0011)、Streptococcus(p=0.0002)、Corynebacterium(p=0.00005)、梭菌属(p=0.0035)和Haemophilus(p=0.0001)相对丰度均显著低于原始污水,说明经过一系列的污水处理工艺,绝大多数病原菌得到有效去除。

但值得注意的是,再生水中仍存在一定数目的病原菌,主要是Pseudomonas和Acinetobacter。Pseudomonas包括P.aeruginosa、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、鼻疽假单胞菌(P.glanders)和类鼻疽假单胞菌(P.pseudomallei) 4种。其中P.aeruginosa是医院感染的主要病原之一,感染可引发创面感染、中耳炎、泌尿系统感染,但其属于条件致病菌,一般为继发性感染。Acinetobacter包括醋酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)、鲁菲不动杆菌(A.lwoffi)、鲍曼不动杆菌(A.baumanii)、溶血不动杆菌(A.haemolytius)、琼氏不动杆菌(A.junii)、约翰逊不动杆菌(A.johnsonii)和抗辐射不动杆菌7种。其中,A.baumanii是一种条件致病菌,感染可引发肺炎、菌血症、心内膜炎、皮肤和软组织感染、尿道感染和脑膜炎。由此可见,随着污水处理工艺的一系列处理结合臭氧消毒和紫外消毒,污水中绝大多数病原细菌能得到有效去除/灭活,再生水中仅存在少量条件致病菌,条件致病菌一般属于继发性感染,正常人群极少感染。因此,经过污水处理厂一系列工艺处理结合臭氧、紫外消毒工艺,能对原始污水中的病原菌有较好的去除效果。

图5 病原菌属水平多样性和相对丰度

2.4典型病原菌的定量检测及风险评价

2.4.1嗜肺军团菌和大肠杆菌定量检测

对污水处理厂中的典型病原菌大肠杆菌和嗜肺军团菌进行定量检测(图6),发现在本研究49个样本中,大肠杆菌和嗜肺军团菌检出率均为100%且不存在明显的季节差异。大肠杆菌整体浓度要高于嗜肺军团菌,在进水和污泥中超过8lgcopies/L,嗜肺军团菌为6lgcopies/L。经过生物池、超滤膜和臭氧、紫外消毒后,出水中得到有效降低;嗜肺军团菌较进水降低2.5lgcopies/L,大肠杆菌降低近4lg copies/L,可见污水处理工艺对大肠杆菌有良好的去除效果。在污水处理厂中,嗜肺军团菌和大肠杆菌均在生物池处理后得到有效降低,而臭氧和紫外消毒前后无显著差异。这可能是由于基于PCR扩增的分子检测手段检测的片段只是病原菌核酸的一部分,易造成假阳性结果,高估其真实含量;还需结合培养等手段进一步明晰其在污水处理厂中的存在情况。污水处理厂曝气池污泥中嗜肺军团菌含量较进水高,这是由于污泥中的细菌群落结构多样性更丰富,有机物含量丰富;此外,污泥中大量存在的蓝藻[30]、细菌[31]和阿米巴虫等原生动物[32-33]能作为宿主促进其生长繁殖。

图6 污水处理厂嗜肺军团菌/大肠杆菌含量变化

2.4.2嗜肺军团菌和大肠杆菌风险评估

对污水处理厂中嗜肺军团菌和大肠杆菌进行健康风险评估(图7),发现尽管大肠杆菌的检出浓度要高于嗜肺军团菌,但嗜肺军团菌的患病风险要远高于大肠杆菌。如按意外摄入1m L/d污水计算,进水、曝气池和二沉池中嗜肺军团菌的感染概率都接近1,不过鉴于本研究的病原菌定量是基于核酸片段而非活性的病原菌,实际感染风险应该有高估;超滤膜、臭氧消毒池和紫外消毒池处理后,其风险显著降低,在0.4左右。对于大肠杆菌,整体健康风险都较低,在进水和污泥中风险为0.5,其他工艺段中健康风险都低至可忽略不计。这些结果表明,大肠杆菌作为出水监测指标不能反映其他病原菌的风险水平,需要引入更加严格的病原菌监测指标以保证再生水回用安全;对于污水处理厂内部的从业者而言,其面临的患病风险较高,需要佩戴口罩、手套、面罩、防护服等护具,减少喷溅污水从口鼻摄入的可能,以减少职业病风险。

图7 污水处理厂嗜肺军团菌/大肠杆菌风险评价

3、结论

本研究通过16Sr RNA测序方法系统调查了城市污水处理厂中细菌群落在时间(夏季和冬季)和空间(不同工艺段)上的动态变化、病原菌的去除效果及典型病原菌健康风险。结果表明,污水处理厂中检测到45个菌门,主要是与污水处理相关的功能菌,包括Proteobacteria、Campilobacterota和Bacteroidota。在1180个菌属中,共发现27个潜在病原菌属,主要包括Arcobacter、Pseudomonas、Mycobacterium、Acinetobacter、Aeromonas和Legionella。经过一系列处理,包括指示菌在内的多数潜在致病菌得到有效去除;出水中病原菌含量较进水显著降低,健康风险也达到较低水平。值得注意的是,结果表明常规出水检测指标大肠杆菌难以反映非粪源性病原菌(如嗜肺军团菌)的存在情况和风险等级。

基金资助:国家重点研发计划“政府间国际科技创新合作”重点专项(2019yfe0122400); 中国科学院大学魏桥国科联合实验室科研项目(gyy-dtfz-2022-010);

文章来源:寸淑娟,王宪文,曹平波,等.城市污水处理厂病原菌多样性及健康风险评价[j].净水技术,2024,43(10):77-85.