绿化废弃物是城市绿化建设中的植物因季节更替、人工修剪等原因而产生的植物残体[1]。全国2022年的绿地面积达358.6万公顷，城市绿化覆盖率为43.0%,随之产生的绿化垃圾总量超过1.75亿t, 约占农业秸秆产量的25%,然而在生态环境建设中往往忽视了对其及时妥善的处理，从而造成多种环境问题[2]。随着资源节约循环利用经济的深入，将其作为一类潜在的生物质资源进行转化利用，生产高附价值产品是未来的发展趋势。

绿化废弃物复杂致密的木质纤维素结构是重要的制约因素之一[3],因此往往需要提前通过预处理技术破坏其结构。目前常见的预处理技术如酸碱处理法、离子液体处理法、蒸汽爆破处理法等，普遍存在操作难度高、能耗大、处理工序多的问题。而水热技术是利用热水作为媒介实现半纤维素与纤维素大量降解的清洁处理方式，具有不腐蚀反应器、无后续污染的优点，但高温长时间的降解反应也会累积发酵抑制物[4],降低了微生物转化利用效率，同时不可避免地需要消耗大量热量；另外，新兴的微波萃取技术将电磁能转化为热能，使绿化废弃物在水相环境下迅速升温并发生降解，得到抑制物更少的降解液[5],该技术具有操作简便、反应时间短、可控度高、处理抑制物少、能耗低，可以很好地补充替代水热技术，降低处理过程的碳排放。

由于绿化废弃物经预处理后的降解液中含有大量的可溶性糖[6-8],有利于后续的生物利用。在可再生生物燃料的原料中，微生物发酵产油脂具有生产周期短、转化率高的明显优势，同时无需占用耕地，受气候影响小，被认为是最有应用前景的生物柴油生产原料[9]。然而，微生物利用葡萄糖为碳源发酵产油脂将导致高昂的生产成本，成为其工业应用推广的一大阻碍[10]。探索廉价的发酵底物对微生物产油的影响是该领域的一个重要研究方向，能够有效缓解粮食危机、全球能源短缺等资源环境问题。Donzella等[11]利用南瓜皮酶解液为原料用于酵母培养和油脂生产，生产率为0.26 g/(L·h),每克糖转化为0.24 g的油脂。Matsakas等[12]利用乙酸解毒的桦木片水解液为发酵底物，获得脂质质量浓度为4.0 g/L。Liu等[13]用40 g/L挥发性脂肪酸为碳源培养弯曲隐球菌，实现脂质产量为7.45 g/L。

因此，笔者将水热和微波预处理液作为产油微生物之一的圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides,R.t)培养的唯一营养来源，通过分析其生长曲线、产油脂能力、油脂组成和性质参数等，比较了预处理技术对酵母产油的影响，探索了微波联合产油酵母快速生产生物柴油原料的途径。

1、材料和试剂

1.1 材料

绿化废弃物原料的收集以前期调查以及《成都市城镇绿化树种及常用植物应用规划》为参考，选择四川省成都市区内最常见、应用范围最广的基调树种黄葛、银杏以及骨干树种香樟的叶片垃圾混合物，原料经采集后用水洗净，置于60℃烘箱中烘干至恒重，并用粉碎机磨碎过40目筛。3种粉末以等质量比例进行混合，用以模拟市区内的植物垃圾组分。混合后的原料转移至样品袋，置于-20℃冰箱储存，使用前回温至25℃。

该原料含有13.31%水分、4.21%灰分、63.60%挥发分、18.88%固定碳；元素分析结果为C元素质量分数为47.64%、H元素质量分数为6.28%、N元素质量分数为1.14%、O元素质量分数为44.94%。

1.2 仪器及试剂

主要仪器：MCR-3E常压微波合成萃取仪，上海科兴仪器有限公司生产；DHG-9620A电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司生产；LDZX-75L立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂生产；SW-CJ-1BU洁净工作台，苏净集团安泰空气技术有限公司生产；SKY-2102恒温摇床，上海苏坤实业有限公司生产；pHS-3C+pH计，成都世纪方舟科技有限公司生产；UV-3200紫外/可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司生产；TG-16台式高速离心机，四川蜀科仪器有限公司生产。

主要试剂：葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、98%硫酸、蒽酮、磷酸、香兰素。

2、实验方法

2.1 常压微波预处理萃取

在500 mL圆底烧瓶中放入磁力搅拌子(Φ8 mm×50 mm),加入5 g绿化废弃物原料和100 mL去离子水，搅拌器(转速500 r/min)搅拌5 min至去离子水充分浸润原料，反应样为悬浊液。在微波反应器中搭好装置，提前打开冷凝水，确保反应过程中冷凝水处于开启状态，于350 W功率下反应6 min。该实验组样品编号为MV-350-6。反应结束后，立即取出圆底烧瓶并用冷水冷却至室温以停止反应。所有实验均重复3次。反应结束后，将样品转移至 50 mL离心管中，在转速10 000 r/min下离心8 min后至固液分离。上层预处理液再过1 000目纱布确保无固体残留。

2.2 水热预处理萃取

准备2个100 mL聚四氟乙烯水热反应釜，依次加入2.5 g原料与50 mL去离子水混合，设置反应温度(150℃与180℃)与反应时间(75 min)。待反应结束后，将水热反应釜降温停止反应，待釜内压力恢复至常压后取出反应釜内衬。2个实验组的样品编号依次记为HT-150-75和HT-180-75。预处理结束后同常压微波预处理萃取过程。

2.3 圆红冬孢酵母的培养

将实验室保存的R.t酵母按体积分数1%的接种量接种至YEPD液体培养基，在温度30℃、摇床转速180 r/min的条件下活化培养72 h后，按体积分数10%的接种量转接并继续活化24 h。活化完成后按体积分数10%的接种量接种于以80 mL降解液为培养基的三角瓶中，按上述条件培养48 h, 间隔一定时间取样分析。由于R.t酵母长势较快，Zeng等[14]研究表明，R.t酵母在餐厨垃圾水解液中培养8 h后进入快速生长期，故分别在前14 h间隔2 h、14～30 h间隔4 h、30～48 h间隔6 h取样观察。

2.4 圆红冬孢酵母的生长测定

OD值测定：按标记的培养时间取样后，于600 nm波长处立即测定光密度值；OD值超过1后稀释10倍记录结果，并用马勇等[15]所述的方法换算稀释10倍后实际值的回归方程，得到方程如下：

以OD值为纵坐标，培养时间(h)为横坐标，绘制生长曲线。

生物量测定：用重量法测定酵母的生物量累积，1 000 r/min离心5 min, 菌体用去离子水洗涤，重复2次，于55℃烘干至恒重。

生长速率μ(h-1)的计算式为：

其中：G1和G2分别为某阶段开始时间(t1)和结束时间(t2)时的生物量。

2.5 总糖含量变化测定

采用硫酸-蒽酮法测定样品总糖含量[16]。取一定稀释倍数的待测样品1 mL,加入5 mL现配现用的蒽酮溶液，沸水浴10 min后进行冰浴冷却；以去离子水为空白调零，测定621 nm处的吸光度。

2.6 油脂含量累积测定

采用磷酸-香兰素法测定R.t酵母累积的油脂含量[17]。向酵母固体样品中加入100 μL去离子水、2 mL 98%浓硫酸，沸水浴加热10 min, 并冰浴冷却5 min。加入3 mL新鲜制备的磷酸-香兰素试剂，充分混匀后，显色20 min。以去离子水为空白对照，测定530 nm下的吸光值。

2.7 脂肪酸成分分析

采用氯仿-甲醇法提取R.t酵母中累积的油脂，取0.1 mL的酵母油脂和甲醇溶液发生甲酯化反应，采用GC-MS联用仪检测其中脂肪酸成分，检测条件参考文献[18]。

3、结果与分析

3.1 预处理液性能评价

经过前期预处理条件的探索，明确了预处理降解绿化废弃物的最佳固液比，并通过调整微波处理的功率与时间及水热处理的温度与时间，选出3组降解水平相似的实验组用作R.t产油脂的发酵底物，如表1所示。

表1 不同条件预处理液的基本性质

从表1中可以看出，放大反应体系后的降解液基本性质与前期4 mL反应体系的测试结果差别微弱，说明2种预处理技术均具备稳定性和工业应用的潜力。预处理液中的降解产物主要是可溶性总糖和少量源自植物细胞的氨基酸和蛋白质，整体溶液呈现出高碳氮比，适合产油微生物的利用。而可溶性还原糖一般是微生物优先利用的碳源，在MV-350-6、HT-150-75、HT-180-75 3组实验中，水热预处理能够水解更多的总糖与还原糖供微生物利用，且随着水热反应温度从150℃提升至180℃,溶液中还原糖的含量进一步提升，还原糖占总糖的质量分数依次为77.30%、79.01%、88.31%,印证了水热预处理技术具有能够有效降解纤维素和半纤维素而产生碳水化合物的优势[19]。而尽管微波处理后的降解液碳源质量分数相较另外2组较少，3组之间的差距依然处于非显著的水平(p>0.05)。

预处理后的降解液pH均有所降低，而经微波处理后的MV-350-6降解液变化幅度相较水热 75 min的HT-150-75和HT-180-75更小，说明微波预处理后的酸性副产物总体质量分数更少。由于微波常压水相萃取是利用水等极性分子在电磁场中发生分子自旋并尝试以特定频率与电场对齐，发生摩擦和碰撞导致物料升温[20],而水热技术是利用外源设备提供热量使反应达到指定温度，因此初步认为两者均处于热水环境中发生降解。原料的植物细胞被破坏且释放出的H+使其处于稀酸环境中，继续和木质纤维素发生反应，同时进一步将葡萄糖或木糖等单糖进一步转化为弱酸、醛类及酚类副产物[21],对微生物发酵造成潜在影响。水热高温、长时间的反应使副产物大幅度增多，而微波反应中除了提供热水环境，还会受到离子传导机制和极性分子断键顺序的影响，因此更倾向于剥脱更多的纤维素或半纤维素片段，导致积累更多的非还原糖。

经微波350 W处理6 min后的降解液与水热在150℃反应75 min的效果类似，但微波处理在6 min反应完成，缩短了反应时间并提高了转化效率。由于不同的微生物在发酵时对抑制物的耐受程度不同，糠醛由于影响ATP的产生而被认为是毒性最大的副产物[22],并且在木质纤维素预处理液中很常见。而R.t酵母对抑制物的耐受性较好[23],故未增加对预处理液的解毒、调整pH或添加其他营养物质的步骤，而直接考察2种预处理技术的影响，探索工业上微生物利用最简单的步骤。

3.2 不同预处理液对圆红冬孢酵母生长的影响

圆红冬孢酵母在不同预处理液中的OD600、生物量累积变化情况如图1所示，圆红冬孢酵母在不同预处理液中的生长速率如表2所示。

图1 圆红冬孢酵母在不同预处理液中的OD600、生物量累积变化情况

表2 圆红冬孢酵母在不同预处理液中的生长速率

从图1、表2中可以看出，微波组展现出了明显优势，MV-350-6和HT-150-75比HT-180-75更适合R.t的生长，而前2组的差别并不显著。3组实验组均在发酵约6 h后进入对数生长期，OD值明显上升，而生物量的快速累积比细胞数目的增加延后2 h左右，符合微生物优先利用碳源满足自生细胞生长，而后用于累积生物质的规律。值得注意的是，尽管R.t在HT-150-75中繁殖了更多的细胞，但在生物质的累积上却没有明显的优势，MV-350-6更早地开始增加细胞干重，并且在发酵26 h达到稳定状态。而R.t细胞尽管在HT-180-75中也得到了增长，但OD值和生物量的累积均有显著区别(p<0.05),说明细胞在该环境中受到了胁迫，除乙酸、糠醛类以外，还可能受到了酚类物质的影响，这对R.t发酵过程的影响极为显著[24]。尽管R.t酵母相较于其他微生物抑制剂的耐受性较好，且可以完成微量的自我消化，表现在HT-180-75组生物量的累积图上，酵母没有在6～8 h后预期进入对数生长期，但在12 h后恢复正常生长，说明R.t对于胁迫环境的灵活性[25]。然而，就水热180℃高温反应 75 min而产生的抑制物浓度来说，已经超出了R.t可以长时间代谢分解的限度。

3.3 圆红冬孢酵母对营养成分的利用情况

圆红冬孢酵母在不同预处理液中的总糖消耗及油脂产量情况如图2所示。

图2 圆红冬孢酵母在不同预处理液中的总糖消耗及油脂产量情况

从图2中可以看出，微波预处理液中的R.t酵母在发酵结束时利用了更多总糖，同时在更短的发酵时间内积累更多油脂。3组实验组在发酵0～20 h期间快速消耗总糖，此后酵母对总糖的利用减少，HT-180-75在20 h后逐渐停止了对总糖的消耗，最终消耗率为64.94%;而MV-350-6和HT-150-75持续利用至发酵结束，最终总糖的消耗率分别达85.16%和79.55%。预处理液初始营养成分中，MV-350-6的总糖和还原糖含量都更少，但却更适合R.t利用，且利用率更高，这是由于R.t在微波预处理液中可利用营养成分多样有关[26]。在8～18 h期间，MV-350-6组的R.t酵母累积油脂量与HT-150-75持续拉大，在发酵18 h时累积产量超过97.09 mg/h, 说明微波预处理液的环境更适合R.t的生长与利用。最终总体的糖脂转化率分别为0.120、0.124、0.079 g/g, 略低于Yu等[27]用Trichosporon dermatis产微生物油脂的结果，这是由于R.t积累油脂含量较低的缘故。R.t在3组实验组中的油脂含量累积依次为21.44%、21.42%和18.31%,该转化率与其他产油微生物相比较低，但高于S.mangrovei和C.pyrenoidosa在餐厨垃圾水解液的培养结果[28]。

3.4 圆红冬孢酵母脂肪酸组成分析

R.t在不同降解液和天然培养基YEPD中产生的脂肪酸主要成分如表3所示。

表3 不同培养基的圆红冬孢酵母产脂肪酸组成谱

比较3组实验组和YEPD对照组发现，油酸(C18∶1)都是质量分数最高的脂肪酸，其他主要组成分别是棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)和亚油酸(C18∶2)。而MV-350-6与YEPD培养基得到的脂肪酸组成更为相似，C16～C18的长链脂肪酸在MV-350-6中占92.37%,在YEPD培养的结果中为95.39%,该成分占比在HT-180-75中略少。对比HT-180-75组的脂肪酸成分发现，圆红冬孢在受到生长抑制，处于低pH和糠醛、5-羟甲基糠醛等发酵抑制物组成较多的环境中对碳氮营养元素的利用率明显不足。除了产生的油脂量少，脂肪酸成分中其他短脂肪链的质量分数显著(p<0.05)高于其他组。尽管C18∶1和C16∶0是R.t油脂的主要成分，但在4种环境中得到的比例有明显差异，在YEPD天然培养基中占明显优势，而在预处理液中该比例减小，分别是HT-180-75>HT-150-75>MV-350-6。该结果是由于碳源性质不同而导致的，在YEPD培养基中，圆红冬孢酵母以葡萄糖为唯一碳源，而在预处理降解液中，碳源除了纤维素降解的葡萄糖外还包括半纤维素的主要降解产物木糖、少量果糖、阿拉伯糖、糖醛酸，以及难以直接利用的寡糖片段等，碳源性质的不同导致了R.t利用倾向及脂肪酸产物的不同。

中国(GB 25199—2017)、欧盟(EN 14214:2012+A2:2019)[29]、美国(ASTM D6751)等国家和地区都对生物柴油的品质做出了要求，其中运动黏度、密度、十六烷值、热值是几项重要参数，如表4所示。利用Horkman方法对4组脂肪酸的重点参数进行了估算及预测[30],发现4组实验的数据预测结果如下：相对密度为876 kg/m3左右，运动黏度介于 4.7～4.9 mm2/s之间，十六烷值均大于57,碘值不超过欧盟规定的120 g/100 g。4组结果均符合标准，初步证明可以作为生产生物柴油的途径之一。

表4 圆红冬孢酵母生产的油脂参数与不同国家及地区标准的比较

4、结论

通过圆红冬孢酵母并在以绿化废弃物预处理液为唯一营养物质来源的培养基中发酵产油脂，研究了酵母在发酵过程中对预处理液中营养成分的利用情况，考察了其制备生物柴油的应用潜力，比较得出微波联合圆红冬孢产微生物油脂的优势，不仅解决了公园城市建设中绿化废弃物堆积产生的问题，还为生物处理绿化废弃物实现资源化转化提供了一种简便高效、定向转化的策略，为生物经济与生物质能创新发展提供了技术思路与支撑。

参考文献:

[15]马勇,图雅,陈秀莉,等.分光光度法测定高浓度培养液下的产油酵母菌生长曲线[J].北方园艺,2013,(8):116-118.

[21]吴利娟,吴斌,何冰芳,等.木质纤维素酸解副产物对D-乳酸生产菌Sporolactobacillus sp.Y2-8生长及发酵的影响[J].生物加工过程,2014,12(5):29-33.

[29]蔺建民,夏鑫,陶志平,等.欧洲生物柴油产品标准体系发展对我国的启示[J].现代化工,2021,41(8):1-7.

基金资助:国家自然科学基金面上项目(32270124);四川省科技厅重点研发项目(2021YFS0292);成都市科技局技术研发创新项目(2019-YF05-01962-SN);

文章来源:吴玟仪,李盼禹,张永奎,等.绿化废弃物定向转化产酵母油脂的技术研究[J].现代化工,2024,44(S2):81-86.