脑衰老是指大脑随着年龄的增长而出现的结构改变和功能减退，包括学习和记忆、注意力、决策速度、感官知觉和运动能力的下降[1—3]。脑衰老引起心理和身体健康状况下降，增加脑衰老相关疾病（如神经退行性疾病等）的风险[4]。因此，探索脑衰老的机制及寻找干预衰老的方法对实现“健康老龄化”具有重要意义。近年来的研究揭示了脑衰老的机制[5]，其中“神经炎症理论”认为：随着年龄的增加，衰老个体神经炎性反应增加，主要标志是星形胶质细胞和小胶质细胞（microglia,MG）激活[6]。MG是CNS中的固有免疫细胞，发挥对病原体识别和吞噬细胞等作用，以维持内环境稳定。研究表明，衰老海马MG过度激活，促炎性细胞因子与抗炎细胞因子失衡[7—8]，学习和记忆功能障碍[9]。

众多研究显示，运动能够改善衰老神经炎性反应和认知功能[10—12]，但其分子机制尚不统一，且研究主要集中在行为学和个别基因的表达层面，缺乏采用新的实验技术进行系统性的研究。转录组是物种产生的所有转录本的集合，能够从整体水平研究基因功能，揭示脑衰老发生过程中的分子机制。

本研究基于RNA-Seq技术，筛查出由运动介导的衰老海马组织差异基因—盐诱导激酶1(salt induced kinase 1,SIK1）作为研究的目的基因。SIK1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[13]，在调节代谢稳态中发挥重要作用。SIK1表达水平增多是炎症反应的特征之一[14—15]，并且与神经系统疾病有关[16—17]。但鲜有研究报道运动如何影响SIK1在衰老模型中的表达，基于此，本研究提出科学假设：运动通过调控SIK1及其下游因子NF-κB的表达，改善衰老小鼠的神经炎性反应和空间学习记忆功能（图1），为最终揭示运动延缓脑衰老机制提供实验资料。

1、材料与方法

1.1实验动物与分组

54只雄性C57BL/6小鼠，购于成都达硕实验动物有限公司（中国成都），合格证书：SCXK（川）2015-030。动物分笼饲养于成都体育学院SPF级动物实验中心，每笼4—5只，光/暗循环12h，环境温度（23±3）℃，相对湿度（55±10）%，噪声<50d B，氨浓度<14mg/m3，空气循环24h。小鼠自由饮水、摄食，食物为国家标准啮齿动物饲料，适应性喂养1周后，18只2月龄小鼠作为青年组（C组，n=18),36只13月龄小鼠随机分配到：对照组（A组，n=18）和运动组（E组，n=18）。本研究经成都体育学院伦理委员会批准[2021(13）号]。

图1研究假设

1.2主要试剂

RNA提取液（美国Invitrogen公司）、逆转录体系（加拿大Applied Biological Materials Inc公司）、PCR反应体系（加拿大Applied Biological Materials Inc公司）、蛋白浓度测定试剂（中国碧云天公司）、Iba-1抗体（中国华安生物公司）、SIK1抗体（中国武汉三鹰生物公司）、NF-κB抗体（英国abcam公司）、IL-1β抗体（美国abclonal公司）、β-Actin抗体（美国Affinity公司）、二抗（中国赛默飞生物公司）。

1.3运动干预方案

E组小鼠进行8周有氧跑台运动干预，同时将C、A组小鼠静置于跑台。E组小鼠参考Um HS等[18]运动方案：动物先适应跑台运动5天，每天30min。第一天速度6m/min，第二天8m/min，依次递增至12m/min后速度保持不变。适应性运动结束后，E组小鼠每天以12m/min的速度运动60min，每周5天，共8周。当小鼠停止不运动时，仅轻触尾巴使其继续运动。

1.4 Morris水迷宫测试

E组小鼠运动完成后，采用MWM实验测试所有小鼠的空间学习和记忆功能[19]。定位航行实验：小鼠每天在固定时间进行6天定位航行训练，训练开始时，将站台置于水池圆形平面的第四象限内，从池壁四个起始点的任一点将小鼠面向池壁放入水池，系统自动记录小鼠找到站台的时间（即逃避潜伏期）和轨迹（图2B）。4次训练分别从4个不同的起点（不同象限）放入水中，小鼠找到站台后或120s内找不到站台（逃避潜伏期记为120s），则由实验人员将其引导到平台上休息10s，再继续进行实验，最后以小鼠每天4次训练的平均值评价小鼠空间学习能力。空间探索实验：第6天定位航行实验结束24h后，撤除站台。选择第二象限作为入水点将各组小鼠依次放入水中，记录其60s内穿越平台的次数，并以其平均值评价小鼠空间记忆能力。

1.5取材

水迷宫实验结束后24h，腹腔注射0.5%戊巴比妥钠（50mg/kg）麻醉实验小鼠。每组随机取6例用4%多聚甲醛灌注后，取全脑，浸泡至4%多聚甲醛中，48h后进行石蜡包埋后制作切片用于免疫荧光检测；6例用3%戊二醛溶液（4℃）灌注后，取全脑保存，48h后用于电镜检测；6例颈椎脱臼后于冰上迅速从颅骨中剥离小鼠海马，至于液氮后，转移至-80°冰箱，直至用于RNA-seq、实时PCR和Western Blot检测。

1.6实验方法

1.6.1免疫荧光检测小鼠MG形态和数量：

将固定的脑组织，在30%蔗糖溶液中脱水48h后用石蜡包埋，然后用滑动切片机（RM2016，徕卡）将全脑切成4μm切片。切片复温后，65℃烤片2h，脱蜡复水，EDTA抗原修复液（p H=8.0）进行抗原修复，TBS摇洗，0.3%PBST(Triton-100）透化15min，脑片封闭20min，随后加入一抗（Iba-1,Hua Bio,ET1705-78,1∶100),4℃过夜，复温，TBS摇洗，避光，然后加入第二抗体（Servicebio,GB21303,1∶300）室温孵育1h,TBS摇洗，细胞核用DAPI进行反向染色10min,TBS摇洗，抗荧光淬灭剂封片，随后镜检拍照。选取不相重叠的5个视野进行图像采集，设置同一荧光阈值下分析每张图片的荧光强度，用使用Image J读取每个切片中单位面积的相对荧光强度（Arbitrary Unit,AU/μm2）。

1.6.2电镜检测：

将石蜡组织修成1mm组织块放入装有3%戊二醛的EP管中，4℃条件放置24h,PBS溶液洗涤3次×10min。将组织块放入1%四氧化锇中固定2h,PBS溶液洗涤3次×10min。对海马组织块用30%—100%的丙酮进行梯度脱水后放入环氧丙烷中浸泡5h。树脂包埋海马组织块，超薄切片机对其进行切片（100nm），贴附于铜网格上。用醋酸铀及枸橼酸铅进行双重染色：2%醋酸铀水溶液染色20min，柠檬酸铅染色15min，新鲜蒸馏水洗净。在H-600IV型透射电镜下观察、照相：每个样本观察3张铜网。从左上角向下角呈斜线移动观察每张铜网上神经细胞胞体、突起以的特点并拍摄照片，底片放大8000、15000倍印相。

1.6.3 RNA提取及浓度测定：

采用Trizol法按试剂盒说明书提取海马组织RNA，使用微孔板读取器测量RNA在260nm和280nm处的吸光度来确定浓度和纯度。

1.6.4 RNA-Seq检测：

将制备好的样本交由华大基因公司采用Illumina高通量平台进行RNA-Seq测序。按照流程提取RNA后，取一定量的RNA使用oligo(d T）磁珠富集m RNA，将m RNA片段化，配置一链合成反应体系，合成一链c DNA，配置二链合成反应体系，合成二链c DNA，末端修复、加“A”和接头连接配制反应体系，并设置反应程序，然后修复双链c DNA末端，并在3’末端加上A碱基。配制接头连接反应体系，并设置反应程序，使接头与c DNA连接。配制PCR反应体系，并设置反应程序，对产物进行扩增。并对文库进行质检，将PCR产物变性为单链后，配制环化反应体系，并设置反应程序，得到单链环形产物，消化掉未被环化的线性DNA分子。单链环状DNA分子通过滚环复制，形成一个包含多个拷贝的DNA纳米球（DNB）。将得到的DNBs采用高密度DNA纳米芯片技术，加到芯片上的网状小孔内，通过联合探针锚定聚合技术（c PAS）进行测序。测序获得原始数据后，按照标准分析流程对数据进行处理，滤掉低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的reads，得到过滤后的数据称为clean reads。然后将clean reads比对到参考基因组上，之后进行新转录本预测、SNP&INDEL和差异剪接基因检测。得到新转录本之后，将具有蛋白编码潜力的新转录本加入到参考基因序列中构成一个完整的参考序列，然后计算基因表达水平。转录组定量结果通过差异分析得到各个比较组中转录组相对表达量，并以差异倍数的对数绝对值（|log 2Fold Change|≥0.5),P<0.05为阈值，筛选差异表达基因。

1.6.5实时PCR检测：

按照5×All-In-One RT Master Mix试剂盒说明书配置逆转录体系，将提取的RAN(2μg）加入逆转录反应体系，在PCR仪（Scilogex,TC100-G）上进行反应得到c DNA。随后，按照Eva Green Express 2×q PCR Master Mix-No Dye试剂盒说明书配置PCR反应体系，在全自动荧光PCR仪（上海宏石，SLAN-96S/48P）上进行反应，设计程序为预变性95℃10min,40个循环为95℃，15s、60℃，60s，溶解曲线为60℃→95℃每15s升温0.3℃。反应结束后，以β-actin作为内参基因，根据2-∆∆CT法计算各基因的相对表达量，每个样本进行6个生物学重复。引物序列见表1。

表1目的基因引物序列

1.6.6 Western Blot检测：

海马组织按比例（10μl/mg）放入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂混合液中（10∶1），于冰上裂解10min，离心（﹣4℃、12000r/min),15min后取上清液。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度后变性。然后制胶，上样，采用SDS-PAGE电泳，经两步法将总蛋白分离后，采用湿转法将蛋白质转到PVDF膜上，牛血清蛋白封闭2h，一抗（SIK1:Proteintech,51045-1-1-AP,1∶500;NF-κB:abcam,ab16502,1∶1000;IL-1β:abclonal,A16288,1∶1000;β-Actin:Affinity,AF7018,1∶3000）用牛血清蛋白稀释后4℃孵育过夜，TBST洗膜，二抗（Thermo fisher,32260,1∶5000）室温孵育2h;TBST洗膜后进行ECL化学发光法显影、在凝胶成像仪中成像，获得样品印迹图像。用Image J软件分析积分灰度值，结果用蛋白相对表达量进行计算。

1.7统计学分析

RNA-seq数据使用R 3.5.2分析作图，其余数据以均值±标准差表示，统计方法采用单因素方差分析（one-way ANOVA），事后检验采用LSD，显著性取P<0.05，使用Graph Pad Prism7.0进行数据统计与作图。

2、结果

2.1有氧运动对衰老小鼠学习记忆功能的影响

E组小鼠运动干预结束后24h，采用MWM检测各组小鼠的逃避潜伏期时间和穿越平台次数，结果如表2，图2A所示：第1—2天，三组小鼠平均逃避潜伏期无显著差异。第3天：与C组比，A组逃避潜伏期时间增加（P<0.05）；与A组比，E组逃离潜伏期时间降低，但无显著性差异（P>0.05）。与C组比，A组第4(P<0.05）、5(P<0.01）、6天（P<0.01）逃离潜伏期时间显著增加；与A组比，E组小鼠第4—6天逃离潜伏期时间显著降低（P<0.05）。如图2C所示：与C组（2.67±0.50）比，A组小鼠穿越平台次数（1.00±0.71）减少（P<0.01）；与A组比，E组（2.00±0.71）增加（P<0.01）。

2.2有氧运动对衰老小鼠海马神经元形态的影响

在电镜下观察小鼠海马神经细胞超微结构，见图3。电镜观察：C组海马神经元排列整齐，细胞膜完整且清楚，细胞质中的细胞器较为丰富，核膜光滑完整；A组小鼠海马神经元细胞核核膜皱缩，脂褐素表达增加；胞质中线粒体等细胞器数量较C组明显减少，其中部分线粒体有肿胀与空泡；E组小鼠海马神经元核膜、线粒体明显优于A组小鼠。

2.3有氧运动对衰老小鼠海马MG的影响

采用免疫荧光检测各组小鼠MG数量及形态。DAPI标记细胞核，Iba-1抗体标记MG，见图4。与C组（28.71±4.75）比，A组Iba-1荧光强度（43.32±9.97）增加（P<0.01）；与A组比，E组Iba-1荧光强度（27.36±6.13）降低（P<0.01）。

图2 Morris水迷宫测试结果

注：A平均逃避潜伏时间；B空间探索游泳路径轨迹；C平均穿越平台次数。与C组比，(1)P<0.05,(2)P<0.01；与A组比，(3)P<0.05。

表2平均逃避潜伏期时间

2.4运动对衰老小鼠海马转录水平的影响

采用RNA-seq检测小鼠m RNA表达谱。与C组比，A组175个基因显著上调，66个下调（表3，图5A）；与A组比，E组19个基因显著上调，12个基因下调（表3，图5B）；与C组比，SIK1在A组表达呈上升趋势（P>0.05）；与A组比，E组SIK1表达显著下降（P<0.05）（图5C）。

图3小鼠海马神经元超微结构

注：红色箭头指向细胞核核膜，蓝色箭头指向线粒体，紫色箭头指向脂褐素，黄色箭头示细胞核核膜皱缩

2.5运动对衰老小鼠海马炎性反应的影响

实时PCR检测小鼠海马SIK1、NF-κB、IL-1βm RNA表达。结果显示，与C组比，A组小鼠海马SIK1、NF-κB、IL-1βm-RNA表达显著增加（P<0.05,P<0.01,P<0.05）；与A组比，E组小鼠海马SIK1、NF-κB m-RNA表达减少（P<0.01,P<0.05),IL-1β表达减少，但无显著差异（P>0.05），见表4。

Western Blot检测小鼠海马SIK1、NF-κB、IL-1β蛋白质表达。与C组比，A组SIK1、NF-κB蛋白表达显著增加（P<0.01,P<0.01),IL-1β表达增加，但无显著差异（P>0.05）；与A组比，E组SIK1、NF-κB、IL-1β蛋白表达显著减少（P<0.05,P<0.05,P<0.05），见图6。

3、讨论

大脑重量在20岁以后开始下降[20]，在70岁以后大脑加速萎缩，其中脑室和海马尤为明显[21]。海马结构与学习记忆功能相关，海马萎缩导致学习与记忆能力减退[22]。本研究发现，衰老小鼠平均逃避潜伏期增加，证明衰老小鼠空间学习能力下降；穿越平台次数低于青年组小鼠（P<0.01），证明衰老小鼠空间记忆能力下降。美国国家科学院[6]和国家医学院[7]报告指出：运动能预防老年人认知能力下降、降低老年人患痴呆的风险。本研究发现，运动使衰老小鼠逃避潜伏期时间下降，表明运动组学习能力更强；且穿越平台次数显著增加（P<0.01），表明运动能改善衰老小鼠记忆能力。由此证明，8周跑台运动改善了衰老小鼠的空间学习和记忆功能。

表3差异基因数量

表4 SIK1、NF-κB、IL-1β的RT-PCR 2-△△CT值

神经炎症是导致衰老学习和记忆功能下降的一个重要因素。正常生理条件下，神经元回路在突触形成和消除之间保持平衡，MG通过吞噬多余或受损的神经元在维持神经元稳态和认知修复中起至关重要的作用。研究表明，随着年龄的增长，MG由静息状态变为激活状态，呈变形虫形状，并迁移到炎症部位并分泌细胞因子、趋化因子和活性氧，导致其吞噬作用降低[23—24]。单细胞测序结果显示衰老中MG细胞聚集成簇，促炎亚群增加[25]。Iba-1是MG激活的标记蛋白质之一，衰老小鼠海马中Iba-1阳性细胞数增加[26]。本研究发现衰老小鼠海马神经元形态结构损伤（图3),Iba-1荧光强度和阳性细胞数量增多，从形态学层面证明衰老小鼠神经炎性反应增加（图4）。有氧运动能有效改善全身慢性炎症。9周自主转轮运动可抑制衰老小鼠MG激活，改善学习记忆功能[27];6周的自主跑轮运动减少了衰老小鼠活化的MG数量[28]。本研究结果显示：运动使Iba-1阳性细胞数量减少，荧光强度减弱（图4），表明8周有氧跑台运动可以改善衰老神经炎症。

图4免疫荧光检测结果

衰老神经炎症的分子机制十分复杂，本研究观察到SIK1、NF-κB、IL-1β在衰老小鼠海马组织中表达量增加，证明衰老小鼠海马中SIK1表达上调，促进其下游炎症因子的表达。已有研究表明SIK1在饮酒的小鼠大脑和小鼠原代MG中表达增加，且SIK1降低了NF-κB信号通路因子，MG中SIK1敲低促进了酒精诱导的NF-κB活性[14]。因此SIK1可激活并促进NF-κB的激活，进而促进炎症因子的表达。SIK1于1999年首次在高盐饮食喂养的小鼠肾上腺中发现[29]，它位于人类21号染色体，编码一个含有783个氨基酸的含有泛素相关结构域的丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶。SIK1 N末端有一个丝氨酸-苏氨酸激酶结构域（kinase domain,KD）、一个泛素相关结构域、中心蔗糖非发酵同源性结构域和一个长的C末端结构域组成。KD包含一个肝脏激酶B1(liver kinase B1,LKB1）磷酸化位点，C端结构域包含多个蛋白激酶A(protein kinase A,PKA）磷酸化位点，因此，SIK1由LKB1、PKA调控，在细胞周期调节、糖异生和脂肪生成调节、肌肉生长和分化以及肿瘤抑制等生理过程中发挥作用。SIK1通过转录因子Ⅱ类组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylase,HDAC）和CREB调节的转录共激活剂（CREB regu-lates transcriptional coactivators,CRTC）激活NF-κB[30]。NF-κB调控多种细胞因子、趋化因子的表达，诱导促炎基因如IL-1β的表达[31—32]。本研究观察到8周有氧运动干预后，衰老小鼠海马组织中SIK1、NF-κB、IL-1β表达量减少，证明运动可以在一定程度上抑制衰老小鼠海马SIK1的表达，并且降低SIK1下游NF-κB、IL-1β的表达。药理学研究表明SIK抑制剂减少了促炎细胞因子的表达[33—34]，同时，抑制SIK1可显著降低促炎细胞因子如IL-1β的表达[33]。因此，运动可能是抑制SIK1基因表达的非药物干预手段。Stewart等[35]的实验表明，对老年人进行6个月的有氧和抗阻结合训练，可使IL-6表达降低；Lovatel等[11]对衰老大鼠进行2周跑步训练，发现海马体中的促炎标志物NF-κB、IL-1β表达降低。本研究表明运动可以降低衰老脑促炎细胞因子的表达，减轻炎性反应。说明运动对SIK1的表达有调节作用，SIK1调控NF-κB及其下游炎症因子的表达进而在衰老神经炎性反应中发挥作用。

图5 RNA-Seq结果

图6 SIK1、NF-κB、IL-1β蛋白表达实验结果

4、结论

衰老小鼠海马MG活化，炎性反应增加，神经元形态损伤，空间学习和记忆功能障碍；8周有氧运动调控衰老小鼠海马SIK1、NF-κB、IL-1β基因表达，抑制MG活化，降低脑炎性反应，改善神经元的形态结构，维持海马空间学习和记忆功能。提示：SIK1在运动调控衰老小鼠海马脑炎性反应中发挥重要作用，可能是运动延缓炎性脑衰老、改善学习记忆功能的关键因子。本研究为有氧运动改善衰老认知功能提供了新的理论参考，后续研究还需深入探讨其作用机制，为运动促进健康老龄化的实现提供可靠的理论依据。

基金资助:四川省运动医学重点实验室和国家体育总局重点实验室(2023-A025);成都体育学院“十四五”科学研究创新团队项目(23CXTD02);

文章来源:丁显怡,李雪,周洪莲,等.盐诱导激酶1在有氧运动改善衰老小鼠神经炎性反应和学习记忆功能中的作用[J].中国康复医学杂志,2024,39(11):1572-1580+1605.