研究构树内生真菌次级代谢产物的抗肿瘤活性

2020-08-27 237 上传者：管理员

摘要：目的研究构树内生真菌次级代谢产物的抗肿瘤活性。方法用96孔板接种培养人肝癌细胞株HepG2,人乳腺癌细胞株MCF-7,人肺腺癌细胞株NCI-H1975,人结肠癌细胞株HT-29和人前列腺癌细胞株DU-145,将细胞分为4组:实验组(内生真菌发酵提取物:1.56, 3.13, 6.25, 12.50, 50.00μg·mL-1),空白对照组(0),阴性对照组(0),阳性对照组(阿霉素:0.06, 0.13, 0.25, 0.50, 1.00μg·mL-1)。用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(Methyl-thiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)测定癌细胞增殖情况,计算细胞生长抑制率与半数抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC50)。结果构树内生真菌发酵提取物可抑制HepG2、MCF-7、NCI-H1975、HT-29、DU-145细胞的增殖,并在一定范围内呈明显的质量浓度依赖性,作用72 h后,Alternaria alternata、Gibberella avenacea的次级代谢产物显示较强的细胞毒性,Alternaria alternata对HepG2、DU-145的IC50值分别为(1.13±0.44)和(0.99±0.36)μg·mL-1,Gibberella avenacea对HepG2、MCF7、HT-29的IC50值分别为(1.22±0.38),(0.90±0.27)和(0.56±0.14)μg·mL-1;而Alternaria tenuissima、Fusarium equiseti的次级代谢产物显示较弱的细胞毒性,Alternaria tenuissima对HepG2、NCI-H1975和DU-145的IC50值均大于50.00μg·mL-1,Fusarium equiseti对HepG2、MCF-7、NCI-H1975和HT-29的IC50值大于50.00μg·mL-1。结论构树内生真菌次级代谢产物具有抗肿瘤活性,尤其Alternaria alternata和Gibberella avenacea的活性较强,是潜在的抗肿瘤天然产物新资源。

关键词：
中药活性成分
内生真菌
抗肿瘤
构树
细胞毒性
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药用植物内生真菌作为新型的微生物资源,基于良好的生物多样性与化学多样性,可以作为抗肿瘤活性化合物的来源[1,2]。构树Broussonetia papyrifera (L.)Vent.为桑科构属植物,果实作为中药楮实子应用,茎枝、叶、皮也可药用。构树含有丰富的内生真菌,本文以铅锌逆境适应下构树内生真菌发酵产物的乙酸乙酯部位为试验材料,用四甲基偶氮唑盐微量酶反应法(MTT)对其进行抗肿瘤活性评价,为寻找抗肿瘤活性天然产物提供依据。

材料与方法

1、材料

细胞人肝癌细胞HepG2,人乳腺癌细胞MCF-7,人肺腺癌细胞NCI-H1975,人结肠癌细胞HT-29,人前列腺癌细胞DU-145均购于中国科学院上海细胞库。

药品与试剂构树内生真菌11株菌株为本课题组从构树中分离得到,根据文献方法制备发酵产物的乙酸乙酯部位[3],二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)配制贮存液浓度为4℃保存备用。MTT,购自美国Amresco公司;DMSO,购自美国Sigma公司。

仪器IX51生物倒置荧光显微镜,日本OLYMPUS产品;ELx800酶标仪,美国BioTek产品。

2、实验方法

2.1细胞培养

参照ATCC (American Type Cultrue Collection)相关说明,选择人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7、人肺腺癌细胞NCI-H1975、人结肠癌细胞HT-29、人前列腺癌细胞DU-145。选取生长良好的对数生长期细胞,当细胞处于80%融合状态时,用0.01% EDTA和0.25%胰蛋白酶消化传代,置于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素与链霉素的1640培养液或改良Eagle培养液(dulbecco's modified eagle medium,DMEM),在37℃、5% CO2培养箱中培养。

2.2细胞分组与处置

将实验分为4组:实验组(发酵提取物:1.56, 3.13, 6.25, 12.50, 50.00μg·mL-1),空白对照组(0),阴性对照组(0),阳性对照组(阿霉素:0.06, 0.13, 0.25, 0.50, 1.00μg·mL-1)。

2.3以MTT检测药物对细胞增殖的影响

收集对数生长期的细胞并将其制成细胞悬液,调节细胞浓度后,取100μL接种于96孔培养板上,培养24 h。按照参考文献[4]方法检测,计算细胞抑制率和IC50值。细胞抑制率=[(A阴性组-A实验组)/(A阴性组-A空白组)]×100%。

3、统计学处理

用SPSS 17.0软件进行统计分析。通过机率单位加权回归法(Bliss法)计算IC50值。计量资料以x¯±s表示,用单因素方差分析。

结果

不同质量浓度(1.56, 3.13, 6.25, 12.50, 50.00μg·mL-1)的发酵提取物处理细胞72 h后,均对HepG2、MCF-7、NCI-H1975、HT-29、DU-145细胞的增殖有抑制作用,在一定范围内呈明显的质量浓度依赖性。

Alternaria tenuissima对MCF-7、HT-29的IC50值分别为(39.95±7.33)和(48.91±9.51)μg·mL-1;Fusarium equiseti对DU-145的IC50值为(34.26±2.15)μg·mL-1;其他各提取物对HepG2、MCF-7、NCI-H1975、HT-29、DU-145肿瘤细胞的IC50值均小于50μg·mL-1。

Alternaria alternata对HepG2、DU-145的增殖抑制作用较强,IC50值分别为(1.13±0.44)和(0.99±0.36)μg·mL-1;Fusarium culmorum对DU-145的增殖抑制作用较强,IC50值为(0.95±0.27)μg·mL-1;Fusarium solani对NCI-H1975的增殖抑制作用较强,IC50值为(2.21±0.61)μg·mL-1;Gibberella avenacea对HepG2、MCF7、HT-29的增殖抑制作用较强,IC50值分别为(1.22±0.38)、(0.90±0.27)和(0.56±0.14)μg·mL-1;一株未知菌Unidentified fungus对NCI-H1975增殖抑制作用较强,IC50值为(2.20±0.64)μg·mL-1。因此,内生真菌Alternaria alternata、Gibberella avenacea具有较强的肿瘤细胞增殖抑制作用,可作为抗肿瘤天然产物资源,值得进一步研究。见表1。

表1各组样品对肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)比较

讨论

构树为速生树种,适应性强,在重金属逆境胁迫下,构树及内生真菌有可能出现代谢产物及活性的变化。本文从构树重金属胁迫居群中分离得到的11个内生真菌,通过培养发酵,乙酸乙酯提取,得到内生真菌发酵物乙酸乙酯部位,再采用MTT法考察提取物对HepG2、MCF-7、NCI-H1975、DU-145、HT-29细胞的增殖影响。本研究结果显示,Alternaria alternata、Gibberella avenacea次级代谢产物的细胞增殖抑制作用较强,而Alternaria tenuissima、Fusarium equiseti的细胞增殖抑制作用较弱。由此表明构树内生真菌不同种属之间的次级代谢产物抗肿瘤活性存在较大差异,同一菌株的次级代谢产物对不同肿瘤细胞的增殖抑制作用也存在较大差异,这些作用的差异可能与次级代谢产物的多样性有关。

Alternaria alternata对HepG2和DU-145的增殖抑制作用较强,其IC50值分别为(1.13±0.44)和(0.99±0.36)μg·mL-1。Alternaria alternata为链格孢属真菌,在植物中分布较为广泛,从该属的内生真菌中分得苝醌类、蒽醌类、内酯类以及甾醇类等化合物,显示良好的化学多样性,提示该属真菌可作为天然活性化合物的重要来源。同时其活性与宿主植物及生境也存在密切关系。

参考文献：

[2]孙剑秋,郭良栋,臧威,等.药用植物内生真菌多样性及生态分布[J].中国科学(C辑:生命科学),2008,38(5):475-484.

[3]张春燕.构树内生真菌及其抗肿瘤次级代谢产物研究[D].上海:第二军医大学,2013.

[4]FRESHNEY R I.动物细胞培养:基本技术指南[M].5版.北京:科学出版社,2008:46-47.

余亚茹,王红霞,许重远,黄宝康.构树内生真菌次级代谢产物的抗肿瘤活性研究[J].中国临床药理学杂志,2020,36(16):2425-2427.

基金:国家自然科学基金资助项目(81773831)