上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是研究最早、最广泛的细胞转型机制，参与多种眼部纤维化疾病的病理生理过程，如角膜创伤修复、后发性白内障、增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)、视网膜下纤维化疾病等[1]。胶质细胞间质转化(glial-mesenchymal transition, GMT)作为细胞转型家族的新成员，最先在胶质瘤的机制研究中被描述和定义，与经典的EMT既有相似之处，也有其独特性[2]。Müller细胞是视网膜中重要的神经胶质细胞，具有机械支撑、维持稳态、生理代谢以及维持视网膜的稳定性等作用[3]。各种视网膜病变常伴随Müller细胞变性和损伤，且在病理状态下Müller细胞可发生GMT,与视网膜纤维化疾病密切相关。本文将从GMT概念的提出及其特征出发，重点阐述Müller胶质细胞的活化及其与GMT关系，以及GMT在相关视网膜疾病中的作用和机制，以期为视网膜纤维化疾病的基础研究和临床治疗提供新的视角和参考。

1、GMT的起源和特点

1.1 GMT的起源

GMT的概念起源于胶质瘤的相关研究[4]。EMT是恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程，其在上皮性肿瘤中的作用已得到了广泛的研究和证实，如结直肠癌、乳腺癌等[5-7]。然而，在初始的研究中，胶质瘤是否可以发生EMT或命名为EMT是否科学，存在一定争议。一方面由于胶质瘤细胞缺少典型上皮细胞的特征，命名为“上皮”转换名不副实；另一方面有关胶质瘤细胞是否出现经典的“钙黏蛋白转换(cadherin switch)”尚存在争议[8-9]。所谓“钙黏蛋白转换”,是指EMT过程中出现的E-钙黏蛋白表达降低而N-钙黏蛋白表达升高的过程[10]。近来研究[11]表明，恶性胶质瘤确可发生EMT或EMT样改变，并开始大量使用EMT这一描述。但由于胶质瘤细胞在发生学上来源于神经胶质细胞，因而有学者提议用“胶质间质转化”,即GMT代替EMT,也逐渐为研究者所接受，这也是GMT这一术语的滥觞[2]。

1.2 Müller细胞胶质化与GMT

Müller细胞是视网膜上最主要的胶质细胞，纵贯视网膜全层，在维持视网膜神经血管单元的内环境稳态等方面发挥重要作用[12-13]。Müller细胞在外界环境刺激下可发生胶质化，主要特征包括：Müller细胞肥大、增殖能力增强以及波形蛋白和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)的表达上调[14-15]。这与经典EMT在形态、功能和表型方面的变化具有极大类似性。EMT过程中细胞在形态上从纺锤形变成细长梭形，功能上增殖和迁移能力增强，在表型上E-钙粘蛋白表达降低，而N-钙粘蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、成纤维细胞特异性蛋白-1(fibroblast specific protein-1, FSP-1)表达升高[10]。

目前Müller细胞GMT的相关研究主要聚焦在功能和表型方面，且在相关标志蛋白的检测方面存在一定的争议。GFAP被认为是星形胶质细胞的标志物，但也可以由Müller细胞表达，作为视网膜应激的指标，在多种视网膜疾病中表达升高[16-18]。有研究发现，在转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)刺激下，Müller细胞中谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)表达明显降低[19-20]。Liu等[21]发现乙酰胆碱可逆转链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导的DR小鼠模型中视网膜Müller细胞上的GS表达降低和GFAP的表达升高，并抑制新生血管形成。McGillem等[22]分离了兔视网膜Müller细胞，培养2 d后GFAP和GS开始持续表达，6 d后α-SMA表达逐渐增多，至传代后期甚至出现了GFAP的表达缺失，且伴随着Müller细胞形态的改变。McGillem等[23]在另一项研究中将兔原代Müller细胞注射到兔玻璃体腔中以制作PVR模型，对眼球视网膜切片进行抗原标定时发现，位于色素上皮层部分的Müller细胞大量表达α-SMA,而与对照相比，GFAP的表达无明显变化。Limb等[24]成功分离培养出经典的永生化Müller细胞系(MIO-M1),在对其进行免疫荧光鉴定时发现，MIO-M1可同时表达GFAP及间质细胞标志物α-SMA,证实Müller细胞可发生表型转换。

以上研究表明，Müller细胞的标志蛋白GFAP和GS的表达在体内、体外、不同疾病以及疾病不同阶段存在一定差异，有待进一步深化研究；但相关研究在Müller细胞发生GMT的检测上也存在一定共识，即发生GFAP或GS与间质标志物α-SMA的同时表达，同时伴随着Müller细胞形态和功能的转变。

2、GMT在视网膜疾病中的作用

EMT分为三种类型，1型EMT主要与胚胎发育相关，2型EMT主要与损伤修复、组织再生和器官纤维化相关，3型EMT主要涉及恶性肿瘤相关的表型转化和侵袭[25]。胶质瘤的GMT主要与3型EMT相关，而Müller细胞GMT与2型EMT的特点类似，主要参与视网膜纤维化疾病的病理过程。

2.1糖尿病视网膜病变

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病导致的视网膜微血管损害所引起的一系列病变，主要分为非增殖性DR(non proliferative diabetic retinopathy, NPDR)和增殖性DR(proliferative diabetic retinopathy, PDR)[26]。病理性新生血管的形成是PDR主要标志。新生血管的形成伴随纤维血管膜(fibrovascular membrane, FVM)的形成，其特征是以α-SMA为标志的肌成纤维细胞的大量形成和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的异常蓄积[27]。由于正常视网膜上并不存在表达α-SMA的细胞，因而FVM上的肌成纤维细胞必定来自其他类型细胞的转化和迁移，包括GMT、内皮细胞间质转化(endothelial-mesenchymal transition, EndoMT)、经典的EMT以及巨噬细胞间质转化(macrophage-mesenchymal transition, MMT)等[28-30]。

Müller细胞是视网膜上最主要的大胶质细胞，贯穿视网膜全层，因而Müller细胞的活化迁移及转分化成可产生基质和有收缩能力的肌成纤维细胞可能是视网膜纤维化的关键环节[31-32]。Yes相关蛋白(Yes-associated protein, YAP)信号通路是Müller细胞活化的重要调控途径[31]。YAP在DR大鼠视网膜中的表达增加，血浆来源外泌体通过靶向YAP信号激活PI3K-Akt通路促进Müller细胞增殖、迁移和GMT,使用YAP抑制剂能阻断Müller细胞增生、分化和ECM产生[33]。ECM硬度增加可刺激YAP活化和促纤维化因子表达，进而诱导Müller细胞持续活化并分化为肌成纤维细胞；ECM的产生促进了肌成纤维细胞的增殖，从而进一步增加了ECM的硬度并刺激了YAP的激活，这种ECM-YAP-GMT-ECM构成的正反馈环路导致视网膜纤维化的持续形成[34],为临床探索靶向YAP信号通路抑制GMT从而治疗DR视网膜纤维化奠定了理论基础。

Kim等[27]对11例PDR患者的FVM进行了特定标记物表征及细胞分离培养，首先在对6例FVM的免疫组化标记中发现血管周围和基质内存在GFAP及α-SMA的共定位，随后对余下的FVM进行体外分离并成功传代α-SMA、CD31、GFAP阳性的3种细胞，表明GMT参与了Müller细胞转分化过程，同时也证明此过程还涉及EndoMT过程。Zhou等[35]在对FVM的免疫组化分析中也发现了GMT现象，同时通过对STZ诱导的糖尿病小鼠视网膜切片进行免疫荧光共定位分析发现Müller细胞上α-SMA及N-钙粘蛋白表达明显增高，该研究还发现，Snail在促进Müller细胞发生GMT的同时还促进了Müller细胞GFAP的表达，表明Müller细胞的活化与转分化之间可能存在某种串扰关系。Xue等[36]发现，人参皂苷Rg1可逆转高糖诱导的Müller细胞间质标志物α-SMA、N-钙粘蛋白的表达上调，表明Rg1可通过抑制Müller细胞GMT发挥一定的抗纤维化作用。Luo等[37]对暴露于含有TGF-βl的高糖培养液的Müller细胞进行检测后发现，α-SMA和纤维粘连蛋白(fibronectin, FN)的表达明显增高，同时Müller细胞迁移功能增强，表明高糖和TGF-βl可协同促进Müller细胞的活化及GMT过程。Wu等[32]研究发现，TGF-β诱导的GMT和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)诱导的视网膜血管生成介导了Müller细胞向肌成纤维细胞的转分化过程，并促进了DR视网膜纤维化的进展。

研究表明，FVM微血管密度、GFAP表达量与PDR分期呈正相关[38-39]。陈松教授团队使用CD31荧光染色量化微血管密度，并首次采用GMT指数(GFAP/α-SMA的相对表达比)这一指标半量化FVM的GMT程度，并评价玻璃体腔内注射雷珠单抗对PDR患者血管生成及Müller细胞胶质活性的影响。结果表明，雷珠单抗可明显降低FVM上微血管密度以及Müller细胞胶质活性，促进GMT过程和α-SMA的表达，并导致FVM的成熟及收缩性增强[39]。类似研究[40]指出，抗VEGF治疗后会增加FVM的收缩力。雷珠单抗可导致Müller细胞中炎症因子白介素-18(interleukin, IL-18)以及TGF-β等促进细胞转型和纤维化相关因子的释放[41-42]。微血管密度降低的可能机制是EndoMT引起的血管收缩和CD31表达减少，并诱导FVM中血管内皮细胞凋亡[43]。单纯的抗VEGF治疗虽然降低了新生血管密度，但也增加了血管纤维化风险，因而有学者提出双靶点治疗的策略，即抑制视网膜新生血管和抑制纤维化在DR的治疗中同样重要。

Müller细胞的GMT过程还参与了糖尿病性黄斑水肿的形成。DR患者的内界膜上附着多种细胞成分，包括胶质细胞、肌成纤维细胞、巨噬细胞和多种炎症细胞，且GFAP及α-SMA呈现高表达，表明内界膜上出现了胶质细胞的活化及间质转化[29]。Müller胶质细胞的活化增多为α-SMA阳性的肌成纤维细胞提供了收缩的支架，并产生切向牵引导致视网膜增厚。DR患者内界膜中Ⅳ型胶原蛋白增多，同时出现了原本不存在的纤维粘连蛋白(FN阳性)和肌成纤维细胞蛋白(α-SMA阳性),暗示了Müller细胞介导的GMT和纤维化过程可能通过改变内界膜上细胞的蛋白成分而影响内界膜厚度[44-45]。以上研究提示：高糖刺激导致Müller细胞增生与转分化，进而引起内界膜厚度的增加和玻璃体黄斑界面牵引力的增加，促进黄斑水肿的形成。

Hu等[46]通过对FVM进行单细胞测序研究发现，FVM上表达Ⅰ型胶原(COL1A1、COL1A2),表明成纤维细胞参与FVM形成；免疫荧光发现小胶质细胞标志物IBA1和FN存在共定位，表明小胶质细胞GMT在FVM的形成过程中也发挥重要作用。

2.2特发性黄斑前膜和黄斑裂孔

特发性黄斑前膜(idiopathic epiretinal membrane, iERM)是肌成纤维细胞在视网膜前增殖形成的无血管纤维膜。肌成纤维细胞的增殖、迁移和转分化被认为是iERM形成和进展的关键环节，并与ECM和胶原的形成以及收缩活性的产生密切相关[19]。超微结构观察、免疫组化分析以及基因表达分析表明，多种细胞类型如神经胶质细胞(包括小胶质细胞、Müller细胞和星形胶质细胞)、透明细胞、视网膜色素上皮细胞、血源性免疫细胞和肌成纤维细胞等被确定参与iERM形成，其中Müller细胞、透明细胞和肌成纤维细胞是iERM中最主要的细胞类型[47-48]。

Bu等[49]检测了iERM患者黄斑前膜标本后发现了GFAP和α-SMA的共定位，证实GMT促进了视网膜前膜的形成；体外研究发现，Müller细胞和透明细胞产生的TGF-β1可通过自分泌或旁分泌的方式促进Müller细胞表达α-SMA和Ⅰ型胶原，从而促进细胞收缩性和胶原沉积。Krishna Chandran等[50]报道了玻璃体成分诱导的GMT在iERM形成过程中起关键作用。根据不同iERM玻璃体成分对GMT相关基因表达的影响差异将GMT分为“完全GMT”和“部分GMT”两种形式，“完全GMT”的Müller细胞同时发生视黄醇结合蛋白1(retinaldehyde-binding protein 1, RLBP1)和GFAP的下调以及成纤维细胞标记物肌动蛋白α2(actin alpha 2, ACTA2)和转胶蛋白(transgelin, TAGLN)的显著上调；而对照组玻璃体样品对Müller细胞ACTA2和TAGLN的表达没有影响，仅引起RLBP1和GFAP的表达下调，故称之为“部分GMT”。由于该研究是直接将玻璃体成分用于体外刺激Müller细胞，未对iERM发病前后玻璃体成分差异进行检测，因而无法区分玻璃体成分变化与GMT或黄斑前膜之间的因果关系。Song等[51]探讨了IL-4对白内障术后iERM形成及早期进展的影响。iERM患者白内障术前房水样本中IL-4浓度明显高于无iERM的白内障患者，体外研究表明，IL-4可通过不依赖于TGF-β1的方式刺激Müller胶质细胞增殖、迁移和GMT,在iERM形成中发挥重要的促纤维化作用。

黄斑裂孔是一种具有复杂发病机制的玻璃体黄斑界面疾病。Müller细胞末端参与形成玻璃体黄斑界面，是黄斑牵引力产生的重要介质和响应者，因而存在Müller细胞发生转分化及纤维化的结构基础[52]。Bu等[53]获取了与黄斑裂孔形成相关的黄斑前膜标本进行检测后发现，细胞增殖明显的黄斑前膜术中内界膜的剥离难度较大，密集增殖的细胞存在GFAP和α-SMA的共定位以及Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅴ型胶原沉积，表明Müller细胞转分化参与了黄斑裂孔相关ERM的形成；ERM中新形成的胶原和增殖的细胞可以诱导玻璃体视网膜粘连增强，促进黄斑裂孔形成，也导致手术难度的增加。Schumann等[54]也发现黄斑裂孔的形成与内界膜上细胞的迁移和增殖有关，透射电镜和免疫组化结果表明内界膜上胶质细胞和透明细胞占主导地位，且在胶质细胞和透明细胞中均出现了α-SMA的表达。因而胶质细胞的增殖和转分化导致的玻璃体视网膜界面的切向牵引力增加可能是黄斑裂孔进展的主要原因之一。

2.3年龄相关性黄斑变性

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, ARMD)是老年人群低视力乃至失明的主要原因[55]。新生血管性ARMD(neovascular age-related macular degeneration, nARMD)也称为渗出性或湿性ARMD,占ARMD相关病变所致视力损失的90%以上[55]。纤维化瘢痕形成是nARMD患者预后差的重要指标，因而及时破解视网膜下纤维化的分子机制具有重要意义。同其他纤维化疾病类似，视网膜下纤维化特点也是肌成纤维细胞的大量形成以及ECM蛋白的过量沉积，其细胞成分还包括神经胶质细胞、免疫细胞和视网膜色素上皮细胞等[56-57]。

研究[56]表明，中枢神经系统中的纤维化病灶包含致密的胶质瘢痕，该瘢痕主要由胶质细胞构成，可将炎症局限于病灶核心，以减少周围正常神经组织的损伤。Jo等[58]采用激光灼伤Bruch膜及视网膜下注射巨噬细胞的方法建立小鼠视网膜下纤维化模型，免疫组化发现视网膜下α-SMA的表达初步验证了模型的可靠性；为进一步评估模型的效率，GFAP作为间接指标用于量化纤维化面积，结果发现大部分GFAP阳性区域呈瘢痕状，且免疫荧光实验发现GFAP与直接纤维化指标Ⅰ型胶原存在几乎重合的共定位表达，表明巨噬细胞可促进胶质细胞发生GMT从而促进视网膜下纤维化。该研究[58]还发现活化的巨噬细胞可促进RPE细胞分泌炎症因子诱导自身EMT参与视网膜下纤维化进程，表明GMT和EMT之间可能存在一定串扰或级联放大机制，协同促进疾病进程。

Yi等[59]发现巨噬细胞标志物F4/80与Ⅰ型胶原标志物COL1的共表达，同时在人眼黄斑纤维化组织中发现小胶质细胞标志蛋白IBA1和基质金属蛋白酶-12(matrix metalloproteinase-12, MMP-12)的共表达，提示巨噬细胞MMT和小胶质细胞GMT参与了纤维化过程。还有研究表明，EndoMT、周细胞-肌成纤维细胞转化(pericyte-myofibroblast transition, PMT)过程在诱导视网膜下新生血管及纤维化进程中起重要作用[60-62]。因此，破解各种细胞转型之间的交互作用和共同靶点于nARMD的治疗具有重要意义。

2.4 PVR

PVR是眼外伤、孔源性视网膜脱离及玻璃体视网膜手术后的常见并发症，其主要特征是在视网膜前形成的无血管纤维膜。RPE细胞通过EMT转分化形成肌成纤维细胞而导致的增殖膜的收缩是导致视网膜复位手术失败的重要原因[63]。超微结构和免疫病理研究[64]表明，多种细胞参与PVR的发生与发展，如RPE细胞、神经胶质细胞和肌成纤维细胞等，因而胶质细胞在PVR发生、发展中的作用也不容忽视。

Motulsky等[65]发现水通道蛋白-1(aquaporin-1, AQP1)在继发于视网膜脱离患者的PVR膜上有表达，且主要表达在增生膜的边缘，并分别与α-SMA或GFAP共定位；由于增生膜边缘的细胞通常是参与增殖和迁移的前沿细胞，推测AQP1阳性细胞可能是转分化的胶质细胞，并因此获得较强的迁移、增殖能力，促进增生膜的形成。TGF-β抑制剂Galunisertib可通过抑制SMAD2/3通路抑制TGF-β诱导的Müller细胞迁移、增殖以及GMT,减少细胞的活动性和收缩性，降低视网膜前膜牵引力的形成，为玻璃体视网膜纤维收缩性疾病的治疗提供了新的干预靶点[20]。Bu等[66]发现机械应力和基质硬度与纤维化密切相关，基质硬化显著促进了α-SMA阳性的Müller细胞应力纤维的有序排列，而在软性基质中培养的Müller细胞中α-SMA表达不明显，且应力纤维紊乱。在视网膜纤维化过程中，视网膜Müller细胞从“较软”的视网膜内环境中迁移到内界膜时遭遇到“更硬”的环境，促进了Müller细胞形态改变和α-SMA的表达，有助于Müller细胞获得肌成纤维细胞样表型。组织硬度的增加可以提供细胞外微环境，进一步促进视网膜Müller细胞中α-SMA的上调以及视网膜收缩；此外，TGF-β的存在增强了这一过程中肌成纤维细胞样细胞胶原的分泌和沉积，进一步促进了ECM硬度的增加[66],该研究有助于从组织工程角度寻找治疗视网膜增殖和纤维化的治疗策略。

Gerhart等[67]检测了3例继发于外伤性视网膜脱离患者的PVR增殖膜上Myo/Nog细胞及纤维化蛋白的表达。其中的2例切片中80%以上的细胞同时表达Myo/Nog细胞标志蛋白G8和Noggin,且大多数Myo/Nog细胞中存在α-SMA的表达，提示PVR增殖膜中的收缩性肌成纤维细胞还可能来源于分化的Myo/Nog细胞。该研究为进一步破解视网膜纤维化增殖膜中收缩细胞的起源问题提供了新的思路。

3、总结与展望

综上所述，Müller细胞GMT是细胞转型家族的重要成员，Müller细胞通过GMT发生形态、表型和功能方面的改变，在视网膜纤维化疾病中发挥关键作用。然而，相关研究仍存在以下问题：(1)GMT的研究并不成熟，目前并无统一的定义和检测标准，于疾病发生的早期标志物研究是个严峻挑战；(2)GMT在相关疾病发生过程中的精确生物学效应和相关分子调控机制尚不明确；(3)Müller细胞GMT与其他类型胶质细胞(小胶质细胞、星形胶质细胞)GMT之间有何异同和关系以及GMT和其他细胞转型类型(如EMT、EndoMT、MMT、PMT等)之间的交互关系有待深入探索；(4)Müller细胞GMT介导的视网膜纤维化与新生血管形成的关系以及如何平衡抗-VEGF治疗与抗纤维化治疗的双靶点关系也是亟待解决的问题。因此，仍需进一步基础研究和临床证据的支持，从而全面揭示GMT在视网膜疾病中的作用机制，为相关生物标志物的探索和抗纤维化药物的临床转化提供有力的科学依据。

基金资助:宿迁市自然科学基金项目(No.K202312);南京医科大学科技发展基金项目(No.NMUB20220215)~~;

文章来源:王乾坤,索龙,刘爽.Müller细胞胶质间质转化在视网膜纤维化疾病中的作用[J].国际眼科杂志,2024,24(11):1747-1752.