cART是目前公认的艾滋病有效治疗措施,但其仍存在耐药性[1]不良反应[2]､部分患者免疫重建不良[3]等问题｡唐草片是由国家药品监督管理局批准上市的用于治疗艾滋病的纯中药制剂,已在国内外2万余艾滋病患者中使用近20年[4],可促进艾滋病患者的免疫重建､改善临床症状､降低cART的不良反应[5-6],但其治疗艾滋病的机制仍不清楚｡艾滋病是因感染HIV导致机体免疫功能缺陷,而引发的包含各种机会性感染和肿瘤的综合征,与艾滋病相关的各种病理变化,构成一个以HIV感染为核心的病理变化网络,唐草片作为中药复方,其包含多种成分,针对多个靶点,在人体中发挥的功效亦构成一个复杂的药效网络,因此,借助网络药理学,从整体性､系统性角度出发,有助于揭示唐草片治疗艾滋病的机制,为后续相关研究提供参考｡

1、资料与方法

1.1资料来源

1.1.1获取唐草片成分与靶点

通过中医药系统药理学分析平台(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/)收集唐草片各味药物的成分,以口服利用度≥30%､类药性≥0.18进行活性成分筛选[7],之后,在SwissADME平台(http://www.swissadme.ch/),以胃肠道吸收的得分为“high”,类药性至少通过2个“YES”为条件进行再次筛选[8]｡将所得成分的结构式输入SwissTarget⁃Prediction数据库(http://swisstargetprediction.ch/),物种选择人类,获取唐草片活性成分的潜在作用靶点｡

1.1.2获取艾滋病靶点､唐草片与艾滋病交集靶点

在GeneCards(https://www. genecards. org/)､OMIM数据库(https://omim.org/)数据库中,以“Ac⁃quired immune deficiency syndrome”为检索词获取疾病靶点,如GeneCards所得靶点较多,则选取Rele⁃vance score>中位数的值,取OMIM中具有Approved Symbol的靶点,将两者合并去重,再将疾病靶点与唐草片成分靶点取交集,并用韦恩图(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)进行可视化,筛选出唐草片治疗艾滋病的潜在作用靶点｡

1.2方法

1.2.1构建唐草片与艾滋病蛋白互作网络

将唐草片治疗艾滋病的潜在作用靶点导入STRING数据库(https://cn.string-db.org/),物种选择人类,以互作关系最低得分=0.4为筛选条件,隐藏网络中的孤立节点,得到蛋白互作(Protein-Protein Interaction,PPI)网络,将其导入CytoScape3.9.1中,用CytoNCA插件进行拓扑分析,插件中的中介中心性(between centrali⁃ty,BC)､接近中心性(closeness centrality,CC)､度中心性(degree centrality,DC)､特征向量中心性(eigen⁃vector centrality,EC)､网络中心性(network centrality,NC)､局 部 平 均 连 通 性(local average connectivity,LAC)这六个参数[9]能综合反映某一节点在网络中的重要程度,因此,以同时大于这6个参数的中位数为条件进行核心靶点筛选｡

1.2.2构建药物-活性成分-靶点网络

利用Cyto⁃Scape3.9.1构建药物-成分-靶点图,并进行拓扑分析,根据Degree值大小来筛选唐草片治疗艾滋病的关键成分,Degree值代表该节点在网络中连接的节点数目,数值越大则在网络中越重要[9]｡

1.2.3分子对接

从TCMSP数据库获取关键成分3D结构图,从蛋白质结构数据库(https://www.rcsb.org/)获取核心靶蛋白3D结构图,使用PyMOL软件对蛋白受体进行去水､去配体,之后,将关键成分与靶点导入AutoDockTools1.5.7软件,进行加氢,确定活性口袋,然后计算对接结合能｡当结合能<0 kcal/mol时,表示受体与配体可以自发的结合,而无须外部能量,当结合能<-5 kcal/mol,表明结合活性较佳[10]｡

1.3统计分析

将筛选出的交集基因导入DAVID(https://david.ncifcrf.gov)数据库,以P<0.05为筛选条件,进行基因本体(Gene Ontology,GO)分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析｡富集基因数目(count)为富集到GO或KEGG某一条目上的基因数,基因比率(gene ratio)为一个分数,分子为富集到该条目的基因数,分母为所有输入的做富集分析的基因数(即交集基因数),富集基因数目与基因比率可反映交集基因中有多少基因与该条目的功能或路径相关｡按富集基因数目大小排序,对排名靠前的条目在微生信(www.bioinformatics.com.cn/)网站进行可视化处理,并对前20条KEGG通路进行文献检索,筛选出其中与艾滋病密切相关的通路,唐草片可能借助这些通路发挥对艾滋病的治疗作用｡

2、结果

2.1唐草片活性成分与靶点

按所设定的筛选方法,得到唐草片活性成分217个,其中老鹳草5个,金银花11个,木棉花5个,白花蛇舌草3个,柴胡13个,香薷13个,黄芪14个,糯稻根2个,鸡血藤16个,瓜蒌3个,红花11个,石榴皮6个,诃子5个,银杏叶13个,马齿苋5个,胡黄连3个,龙葵4个,甘草85个,菱角与全蝎未检索到活性成分,剔除重复成分后共计166个活性成分｡166个活性成分经SwissTargetPre⁃diction预测并去除重复后,获得1 035个潜在靶点｡1261

2.2 艾 滋 病 靶 点

以“Acquired immune deficiency syndrome”,在GeneCards数据库中检索得到9 431个条目,按照Relevance score>中位数,筛选得到1 178个条目,在OMIM中检索得到244个条目,共计1 422个条目,去重后得到1 335个疾病靶点,将其与1 035个唐草片活性靶点取交集,得到190个共同靶点,见图1｡

2.3 PPI网络的构建

将唐草片与艾滋病的共同靶点输入STRING数据库中,构建PPI网络图｡去除2个游离节点后,得到188个节点,与3 105条代表相互作用的边,利用CytoNCA插件,按BC､CC､DC､EC､NC､LAC均大于中位数进行2次筛选后,得出20个网 络 核 心 靶 点,见 图2,颜 色 越 深 代 表Degree值越大｡

2.4药物-活性成分-靶点网络构建

将唐草片的活性成分与药物作用靶点录入CytoScape3.9.1中,构建药物-活性成分-作用靶点网络,该网络有462个节点,4 031条边,见图3｡将Degree值排名前10位作为唐草片治疗艾滋病的核心成分,并结合相关文献,筛选得到5个关键成分,见表1｡

2.5富集分析

GO富集分析中的细胞生物过程主要涉及磷酸化､RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控､信号转导､蛋白质磷酸化等;细胞组分主要涉及质膜､胞质溶胶､细胞质等,分子功能主要涉及蛋白结合､相同蛋白结合､ATP结合等,见图4｡KEGG通路得到169条,对富集基因数排名前20的通路进行文献检索､筛选后发现,磷脂酰肌醇-3-激酶(phospha⁃tidylinositol 3 kinase,PI3K)/丝氨酸/苏氨酸激酶(Ser⁃ine/threonine-protein kinase,AKT)信号通路､丝裂原活 化 蛋 白 激 酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路､Ras信号通路可能为唐草片治疗艾滋病的重要通路,见图5｡

2.6分子对接

图1唐草片-艾滋病韦恩图

图2唐草片治疗艾滋病的PPI网络图与核心靶点筛选

表1唐草片的关键活性成分

图3唐草片治疗艾滋病的中药-成分-靶点网络

将5个关键成分与度值排名前5的核心靶点进行分子对接,对接结果见图6｡对接结果

显示,AKT1､白介素6(Interleukin-6,IL-6)与5种关键成分的对接结合能均小于-5 kcal/mol,表明它们之间的结合活性均较佳,此外,表皮生长因子受体(epi⁃dermal growth factor receptor,EGFR)与槲皮素､木犀草素､黄芩素､异鼠李素的结合活性较佳,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)与槲皮素､木犀草素的结合活性较佳,信号转导与转录激活因子3(Sig⁃nal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3)与黄芩素结合活性较佳,将对接分数前4组,用PyMol2.6进行可视化,见图7｡

3、讨论

唐草片以老鹳草为君药,臣以金银花透热解毒,柴胡､香薷宣通腠理､调畅三焦气津,黄芪扶正祛邪,佐瓜蒌润肺化痰,木棉花､马齿苋､胡黄连､白花蛇舌草､龙葵清热除湿,菱角､糯稻根益气养胃,红花､银杏叶､鸡血藤､全蝎活血通络,甘草为使,调和诸药,共奏清热除湿､益气活血之效｡

本研究发现唐草片可能通过多种成分治疗艾滋病,如槲皮素､木犀草素､山柰酚､黄芩素､异鼠李素等｡研究表明,槲皮素可作用于蛋白酶､反转录酶､整合酶以抑制HIV的复制[11];木犀草素可抑制HIV1反转录酶与整合酶的活性[12];山柰酚亦可抑制HIV整合酶活性[13],并可在HIV感染早期抑制病毒反转录[14];黄芩素可使HIV-1整合酶构象发生改变､抑制HIV-1蛋白酶的合成,干扰HIV的RNA与反转录酶的结合,抑制HIV的复制[15];异鼠李素和槲皮素还可能通过靶向整合酶､反转录酶､TNF-α､核因子κB实现对HIV-1的最佳抑制效果,由于这些化合物对各种靶机制具有高抑制活性,因此它们的协同作用可能 比 单 独 使 用 单 一 化 合 物 对 病 毒 的 抑 制 效 果更大[16]｡

PPI网络分析结果显示,唐草片的潜在核心靶点主要为AKT1､IL-6､TNF､STAT3､EGFR｡在25组关键成分与核心靶点的分子对接中,有16组结合活性较佳,其中AKT1､IL-6与五种关键成分均有较好的结合活性｡AKT1是丝氨酸/苏氨酸激酶的一种亚型,是重要的抗凋亡因子[17],在T细胞､B细胞的发

图4 GO功能富集分析气泡图

图5 KEGG通路富集分析气泡图

图6分子对接分数的热图分析

图7唐草片关键成分与核心靶点分子对接可视化图

育､激活､分化过程中发挥重要作用[18];IL-6是由B细胞､T细胞分泌的细胞因子,可促进B细胞分化为浆细胞,促进T细胞活化､增殖,介导炎症反应[19],HIV感染者的IL-6水平显著高于健康人[20],TNF是重要的免疫反应与炎症调节因子,具有抗肿瘤､抗感染的作用,抗原或内毒素可刺激免疫细胞大量分泌TNF-α[21],艾滋病患者的TNF-α水平远高于健康人[22],TNF-α的持续升高可能导致组织损伤,并促使其他疾病的发展[23],STAT3是参与信号传导的转录因子,可抑制干扰素的表达,抑制抗病毒作用,沉默STAT3可 促 进IFN- β的 分 泌[24],STAT3与EGFR､AKT1共同参与潜伏HIV的激活[25],EGFR是一种跨膜蛋白受体,负责胞内信号传导,与肿瘤的发生发展密切相关[26],HIV相关外泌体中的TAR RNA可通过EGFR增强卡波西肉瘤相关疱疹病毒的感染性[27]｡

富集分析显示,唐草片治疗艾滋病主要涉及PI3K-Akt､MAPK､Ras等信号通路｡PI3K-Akt信号通路可促进HIV穿过细胞膜进入胞内,增强T细胞对HIV的易感性,可通过延长被感染巨噬细胞的寿命参与病毒库的维持,促进HIV的复制[28],在HIV感染进程中发挥重要作用;MAPK通路可调节细胞的增殖､分化､迁移､衰老和凋亡过程,HIV-1感染可通过病毒蛋白gp120､Tat和Nef激活MAPK信号通路,而激活MAPK信号通路又可增强病毒感染活性,MAPK信号通路抑制剂可通过负向调节HIV-1病毒启动子的活性以抑制HIV-1的复制[29],HIV-1感染细胞释放的一种多功能蛋白Tat可通过PI3K-Akt和细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)/MAPK通路介导炎症细胞因子产生和神经细胞损伤[30];Ras信号通路可调节细胞的增殖､分化与凋亡过程[31],HIV-1转录激活蛋白可通过Ras信号通路促进HIV相关神经认知障碍发生[32]｡

综上所述,唐草片可能通过槲皮素､木犀草素､山柰酚､黄芩素､异鼠李素等成分,作用于AKT1､IL6､TNF､STAT3､EGFR等潜在核心靶点,调节PI3KAkt､MAPK､Ras等信号通路,干预磷酸化RNA聚合酶II启动子转录的正调控､信号转导等生物过程,治疗艾滋病｡以上预测结果从分子层面阐述了唐草片治疗艾滋病的作用机制,可为后续临床及体内外试验研究提供参考｡本研究的不足之处在于,仅总结了唐草片与艾滋病具有直接联系的成分､靶点､通路作用,而唐草片作为中药复方,其可能通过改善多个系统的病理变化间接改善艾滋病患者的整体病情,这 种 潜 在 的 间 接 治 疗 机 制 有 待 进 一 步 的 探 索 与阐述｡

利益冲突:所有作者声明不存在利益冲突｡

参考文献:

[1]孔令弘,谢小馨,符燕华,等.中国西南地区艾滋病病毒感染者治疗前和获得性抗逆转录病毒耐药性研究[J/OL].中国全科 医 学,2024(2024-07-08).

[2]韦玉素,董文逸,谢志满,等.艾滋病抗病毒治疗药物不良反应研究进展[J].新发传染病电子杂志,2023,8(3):79-83.

[3]王立洋,唐诗,闻颖.艾滋期HIV患者HAART后免疫重建不良的基线相关因素分析[J].实用医学杂志,2021,37(23):3047-3051.

[5]宋业兵,龙海,符燕华,等.唐草片对艾滋病免疫功能重建不良患者的疗效观察[J].中国皮肤性病学杂志,2024,38(3):298-302.

[6]何清辉,黄惠玲,罗美菊.唐草片联合胸腺肽肠溶片对艾滋病高效抗反转录病毒治疗中免疫重建不良的应用效果[J].中外医 学 研 究,2023,21(22):41-44.

[8]孔苑琳,张剑光,苏宏娜,等. UPLC-Q-Exactive-MS/MS结合网络药理学分析五脉绿绒蒿的化学成分及其抗肝纤维化作用机 制[J].中 国 中 药 杂 志,2022,47(22):6097-6116.

[9]肖玉洪,安祯祥.基于GEO数据库､网络药理学及分子对接探讨扶脾柔肝颗粒治疗肝癌的作用机制[J].中国老年学杂志,2024,44(10):2336-2343.

[10]刘佟洋,王荣.基于网络药理学探讨熏洗方治疗肛周脓肿术后创面愈合的作用机制[J].中医临床研究,2023,15(2):1-7.

[11]王晓建,王珊,黄胜阳.天然产物中槲皮素类化合物的抗HIV作用研究[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(17):274-278.

基金资助:四川省中医药管理局中医药科研专项课题(2023MS224);国家“十三五”科技重大专项(2017ZX10205502-001-005)~~;

文章来源:苗丁山,杨琴,兰燕玲,等.基于网络药理学与分子对接技术探讨唐草片治疗艾滋病的机制[J].中国艾滋病性病,2024,30(12):1260-1265.