微球制剂系指药物溶解或分散在生物可降解辅料中而形成的微粒分散体系[1]。由于微球制剂具有长效缓释[2,3]或靶向作用，可以大大提升患者用药的方便性、依从性，在临床上已凸显优势，是一种极具潜力的剂型。注射用亮丙瑞林微球是一种多肽缓释注射剂，主要成分醋酸亮丙瑞林（leuprorelin acetate,LE），为化学合成的水溶性九肽，相对分子质量为1 269，微球骨架材料（载体）为聚乳酸—羟基乙酸共聚物（polylactic/poly glycolic acid,PLGA）或聚乳酸（polylactic acid,PLA）。临床上用于治疗激素依赖性肿瘤（如前列腺癌、乳腺癌、子宫肌瘤和子宫内膜异位等）、青春期性早熟等[4,5]。

1989年，注射用LE微球在日本、美国等国被批准上市，规格为3.75 mg，每1个月注射1次；1995年，每3个月注射1次的LE微球也被美国FDA批准用于临床，规格为11.25 mg[6]。1999年，LE微球进入中国市场。笔者先后对4家企业（以下用A、B、C、D）的LE微球注射剂进行过检验和标准复核，现结合不同企业的工艺、质量标准及检验情况，对LE微球注射剂的主要质量参数及检验结果进行回顾性分析，为该品种的质量控制与评价研究提供一些参考。

1、质量控制回顾与分析

1.1工艺制法

LE微球注射剂的制备方法通常有乳化法、相分离法及喷雾干燥法3种[7,8,9]。

乳化法是已上市微球产品中常用的生产方法[10]，其大致工艺流程为首先将药物的水溶液加入到有机溶剂（一般为二氯甲烷）和聚合物形成的油相溶液中，经过乳化形成油包水初乳W1/O，再将初乳加入到含乳化剂的外水相中，通过搅拌形成W1/O/W2型复乳，在复乳中加入大量水，使二氯甲烷扩散至水中并挥发，得到固化微球。因LE水溶性较好，一般采用此法制备，但载药量、包封率低，突释效应严重是其主要缺点。A企业的产品用此法制备。相分离法是向第一步形成的W1/O型乳液中加入相分离试剂，使高聚物在溶液中溶解度降低。由于高聚物的浓度远远大于药物的浓度，因此可以在聚合物沉淀过程中，实现高聚物对药物的包裹，然后再转移至大量的有机固化试剂中（如硅油），使微球固化，经过搅拌、离心、冻干得到所需微球。该法受高聚物性质影响较大，且存在溶剂残留问题，B、C企业即采用相分离法制备。D企业制备方法比较特殊，在采用项分离法的基础上进一步压膜成型制成，在此不做详述。

1.2制剂进口分析

自上世纪90年代末，LE微球开始进入到我国市场，A、B、C、D四家企业的产品其工艺、规格均有所区别，其中A企业产品进口数量及规格较多，B、C、D企业样本量较少，因此选取A企业产品检验数据作为此次分析的重点。A企业LE微球规格在上市之初为3.75 mg,2000年后增加了1.88 mg规格和11.25mg规格的产品。LE微球的进口量近6年来基本稳定，在2016年达到峰值后有所下降。

1.3主要质量参数

依据LE微球注射剂现行国内外质量标准所列项目，主要质量参数比较研究结果如下。

1.3.1粒径及粒径分布

粒径是影响微球制剂溶出行为的关键因素，通常在1～250μm左右。微球粒径大小与微球药物的溶出相关性显著[11]，通常粒径增大后释放会减慢。某些企业的质量标准中采用“通针性”试验考察微球粒径。由于本品临床应用以皮下注射给药，因此所使用的针头偏短一些而且相对较细，针内径在0.26～0.34 mm之间。试验时，先将微球粉末与所附溶剂混匀形成混悬液，然后用针管吸入并立即压出混悬液，不得有堵针现象发生。显而易见，该检查法只能粗略地考察微球的粒径。为进一步了解产品粒径情况，笔者采用Malvern 2000激光衍射粒度仪（搅拌桨转速2 200 r·min-1；超声时间不少于10 s；颗粒折射率1.520，吸收率0.1，分散剂折射率1.330，遮光度5%～10%），对A、B两企业产品的粒径进行考察，结果见表1（每个规格测定结果为3批次的均值）。由数据可见，A企业3种规格的微球粒径均值基本一致，生产工艺基本稳定。不同制剂工艺的产品粒径差别还是非常显著的，而这些差异在释放行为上也有所体现。

表1粒度及粒径分布测定结果

1.3.2 pH和渗透压

LE微球给药时一般采用皮下注射，由于药品注射后在患者皮下停留时间较长，因此对于患者来说，注射液的pH和渗透压，在与体液值接近时比较容易耐受。pH和渗透压的测定方法通常是将微球粉末与所附溶剂混合均匀成混悬溶液后测定。A、B两企业产品的pH和渗透压比测定结果见表2。pH在中性略偏酸性的区间，渗透压比则随着主成分浓度的提升而升高。除11.25 mg规格外，其他产品基本在等渗范围内。

表2 pH和渗透压比的测定结果

1.3.3溶剂残留

A、B两企业的LE微球制备方法不同，但生产工艺所用PLGA均需用二氯甲烷溶解，B企业的产品还用到了正庚烷作为硬化剂，因此需对工艺中用到的有机溶剂残留量进行控制。C企业则使用DL-丙交酯-乙交酯共聚物溶解于N-甲基-2-吡咯烷酮中制成载体，临用时与醋酸亮丙瑞林冻干粉末进行混合制成微球，载体中N-甲基-2-吡咯烷酮含量根据主成分规格的不同控制在42.0%～69.0%之间，7.5、22.5及45 mg 3种规格样品测定结果平均值分别为62.5%、52.8%及49.4%(n=3）。二氯甲烷按中国药典规定属于应该限制使用的溶剂，限度为0.06%(g/g),A企业2012年～2018的样品检出二氯甲烷残留量在0.000 8%～0.0032%(g/g）之间，表明其在残留溶剂去除方面工艺基本稳定。B企业样品二氯甲烷含量较高，二氯甲烷的实际检出约为0.1%(g/g）。二氯甲烷残留量的差异也验证了相分离法的残留溶剂去除不如乳化法彻底。另外B企业样品正庚烷实际检出约为2.9%(g/g），二氯甲烷与正庚烷均超出《中华人民共和国药典》残留溶剂项下规定。根据ICH规定，二氯甲烷与正庚烷的允许日接触量分别为6.0 mg·d-1和50 mg·d-1，但由于本品为缓释长效制剂，一般情况下每4周注射1支（3.75 mg规格），按日均接触量小于ICH规定。从实验数据可以看出，由于工艺不同，A、B两企业的同一种残留溶剂去除水平还存在很大差异。

1.3.4释放度

LE微球注射剂体外释放度测定方法分为常速释放和加速释放2种方式。常速释放实验周期较长，一般为15～30 d，为了能够快速监控批间产品质量的一致性，加速释放法应用较多，实验周期较短，一般在48～120 h之间。常速和加速实验方法有直接释药法、透析膜扩散法、流通池法等[12,13,14,15]。直接释药法是将微球直接放入装有释放介质的容器中，一般为具塞平底玻璃瓶，定时取样并补充相应的介质。常用的装置包括恒温水浴、转瓶或摇瓶、恒温箱、摇床等。A、B、C均采用加速直接释药法，其中A、C企业使用水浴摇瓶法，B企业使用水浴静置法。其中A企业水浴摇瓶法根据样品规格的不同有恒温及等间距升温两种模式，温度一般选择有37℃、48℃，均为加速实验。D企业使用常速流通池法，实验周期15 d。

释放介质中通常加入表面活性剂（醋酸亮丙瑞林微球一般使用聚山梨酯80抑制微球聚集，由于常速释放实验时间较长，有一些品种会加入叠氮化钠作为抑菌剂。释放介质的pH一般选择与体液接近的7.4，但Anderson等[16]研究发现微球进入人体后会引起一定程度的炎症反应而产生酸性物质、自由基，这种酸性微环境和由这些细胞产生的酶会导致聚合物的自身催化，加速其降解，所以释放介质有时选用模拟体内环境的pH4.0醋酸盐缓冲液。

药物在微球制剂内的情况一般有3种，即吸附、包入和嵌入，在体外释放实验时，表面吸附的药物会快速释放，称为突释效应，突释效应可能导致人体内药物浓度在短时间内迅速升高，这是限制微球广泛应用的关键问题，因此在质量控制中必须重点关注这一指标。目前主要通过体外释放度实验考察微球的突释效应，《中华人民共和国药典》2015年版规定微球在开始0.5 h内的释放量不得超过40%，设立至少3个取样时间点，第1个点设在释放量约20%的释放初期，第2个点设在释放量约50%的释放中期，最后1个点设在释放量约80%～90%的释放后期，可以监测突释现象，考察终点释药是否完全。上述A、B、C、D 4个企业产品均符合上述要求。

本文考察了A、B、C、D 4家企业产品的体外释放情况，其中A、B、C 3家企业为加速实验，D企业为常速实验，以3.75 mg规格为例，溶出曲线见图1,B企业有1批次样品第一点释放超过20%，其余均符合要求。D企业体外释放度测定方法为常速释放，时间跨度达到15 d，与其他企业有所区别。B、D两企业不同批次样品间释放度存在差异，经分析，应与方法的区分力度及生产工艺的稳定性有关。

图1 3.75 mg规格醋酸亮丙瑞林微球注射剂释放曲线

1.3.5有关物质

LE微球注射剂的有关物质有降解杂质、工艺杂质以及聚合物杂质3个来源。降解杂质一般指药物在生产、储存过程中发生水解、氧化反应而生成的产物；工艺杂质中最为普遍的是乙酰化杂质，这类杂质是由亮丙瑞林肽链中的氨基、羟基与PLGA的羧基末端经过化学反应生成的[17]，该类杂质目前在PLGA微球中广泛存在；聚合物杂质包括多肽自身相聚合形成的杂质，即多肽聚合物杂质。通过反相高效液相色谱法对4个企业LE微球注射剂进行分析，已获知结构的杂质主要有3-D-色氨酸亮丙瑞林、4-D-丝氨酸亮丙瑞林、2-D-组氨酸亮丙瑞林、6-L-亮氨酸亮丙瑞林及4-(O-乙酰-L-丝氨酸）亮丙瑞林等，其中4-(O-乙酰-L-丝氨酸）亮丙瑞林属于乙酰化杂质且与D-酪氨酸亮丙瑞林属于同分异构体，上述杂质在BP 2019醋酸亮丙瑞林原料项下均有收载，归属于降解杂质、聚合物杂质及工艺杂质。A、B、C、D四企业由于工艺不同，所含杂质及其含量也有所区别，但均有含量超过0.3%的单个未知杂质存在，对其毒性和结构应予进一步研究。具体结果见表3。

表3杂质含量测定测定结果表（n=3,%)

由于工艺中使用了二氯甲烷，在供试品溶液制备过程中会有微量二氯甲烷混入水层溶液，而二氯甲烷在210～220 nm处会有一定的紫外吸收，在供试品溶液色谱图中易被误认为杂质峰，见图2。因此在杂质计算时，应将二氯甲烷色谱峰扣除。

图2二氯甲烷色谱图

1.3.6含量测定

该制剂现行质量标准中大多采用反相高效液相色谱法进行亮丙瑞林含量测定，紫外检测波长一般在210～220 nm之间，220 nm比较常用，而210 nm接近紫外吸收末端，溶剂干扰较大。醋酸亮丙瑞林原料易溶于水，但与PLGA等辅料混合制备成微球后则无法用水溶出，因此，供试品溶液制备多用二甲基亚砜为溶剂，将微球辅料与亮丙瑞林同时溶解后直接测定，亮丙瑞林的浓度一般为每1 mL中含50μg。通常采用对照品外标法计算含量。各企业制剂的含量限度控制基本一致，即含亮丙瑞林为标示量的90.0%～110.0%。

本文选取了数据量比较大的A企业，2012～2018年生产的产品共计99批次，对含量进行统计分析，计算出常规统计量，在此基础上分别以规格和生产日期为控制变量进行单因素方差分析，结果见表4～7。由结果可见，制剂中亮丙瑞林含量测定数据基本在100%左右，差异不大。从统计学意义上来说，规格对含量测定结果无显著性影响（P>0.05）。含量测定结果按生产日期计，在不同年份间有一定波动，2017年最低。根据对检验数据的分析，制剂样品含量结果受每支装量的直接影响，微小的差异就会使含量测定结果产生波动。A企业产品的每支装量规格不同，大约在20～50 mg之间，对于1.88 mg规格的样品来说，装量每波动1 mg，含量就会产生约4%的变化。因此在处方工艺未发生变化的情况下，应将关注重点聚焦在装量的精准控制上。

表4基本统计量（控制变量：规格）

表5方差分析结果（控制变量：规格）

表6基本统计量（控制变量：生产日期）

表7方差分析结果（控制变量：生产日期）

1.3.7注射用溶剂

LE微球在临床应用时一般是将微球粉末与所附注射用溶剂混合均匀成混悬液后给患者注射。A、B两企业均使用含甘露醇的溶液作为注射用溶剂，但浓度有所不同，分别为每1 mL中含8 mg与每1 mL含50 mg。该溶剂主要质量控制项目包括性状、鉴别、pH、无菌、细菌内毒素、含量测定等，现行质量标准中含量测定方法有经典的容量滴定法和高效液相色谱法，由于甘露醇没有紫外吸收，因此高效液相色谱法采用通用型的示差折光检测器，以强阳离子钙型交换柱为色谱柱。含量限度在95.0%～105.0%之间。A、B两企业样品质量比较稳定，含量均在标示量的100%左右。

2、LE微球质量分析结果及展望

注射用醋酸亮丙瑞林缓释微球已上市多年，是一个临床应用已成熟的微球类注射剂，通过对上述4个企业产品的质量分析可见，LE微球的产品质量基本上是稳定的，但在该制剂质量控制及其标准方面，还有待提高和完善。

2.1工艺不同，质量控制标准不同

不同企业间的产品由于生产工艺的不同，质量标准也不同，主要体现在粒径、体外释放方法、释放曲线以及有关物质的杂质种类和含量等检测结果的差异，例如，粒径的不同会显著影响到LE微球的体内外的释放过程，但不同粒径的产品在同一体外释放方法下所展现出的差异是仅仅由粒径主导还是由其他质量参数引起有待于进一步证明。另一方面，现有的体外释放检查法多为加速试验，企业进行的体内外相关性研究多为常速试验[18]，但从现有资料和文献上无法获得常速试验及体内试验数据，从现有实验结果上看，有些企业样品的批间差异较大，是方法本身原因还是工艺不稳定所致有待深入研究。

2.2球内无菌问题

由于微球制剂的特殊结构，主药成分被包封在球内，常规无菌检验无法有效检测球内的无菌状况。目前，LE微球的生产企业通常采用过程控制的方式解决此问题，在微球粉末制备完成后随即进行球内无菌检查，合格后在A级无菌条件下进行灌装，此后不再进行球内无菌检查。笔者采用薄膜过滤法，以二甲基亚砜为溶剂，对LE微球的球内无菌进行过考察，并通过了方法学验证。结果表明，虽然二甲基亚砜具有一定的抗菌性，但对微生物芽孢的活性不会产生影响，可以有效地进行检验。由于微球内仅可能有微生物的芽孢存活，且薄膜过滤法所需样品量、试剂成本较高，如每批次产品均进行球内无菌检验就会带来综合成本的提高。因此，采取何种方式对产品进行无菌控制更为安全、有效、操作简便，还有待于进一步探讨。

2.3现行质量标准的不足

依据《中华人民共和国药典》2015年版微粒制剂指导原则，注射用醋酸亮丙瑞林微球现行质量标准中，有关微球制剂的关键质量属性还没有全部体现，特别是缺少微球的载药量和包封率、常用载体PLGA的分子量及其分布等等指标控制。这些涉及微球的关键质量属性的表征有待于深入研究。

参考文献：

[1]郭宁子,辛中帅,杨化新.微球制剂质量控制研究进展[J].中国新药杂志,2015,24(18):2115

[2]徐明新,陶颖,陈园园.长效缓释微球制剂生产技术的发展现状[J].现代生物医学进展,2017,17(19):3772

[3]梅兴国,黄似焕,白承之.注射用缓释微球的国内外发展现状[J].药物研究,2014,31(1):27

[4]梁苑英竹,林晓鸣,刘万卉,等.肽类微球注射剂释放度实验评价研究进展[J].中国新药杂志,2017,26(24):2918

[11]郭宁子,辛中帅,孙悦.激光散射法测定注射用醋酸亮丙瑞林微球粒径及其分布[J].中国新药杂志,2017,26(8):886

[12]彭芳,周凤梅,刘万卉.注射用缓释微球的体外释放度研究状[J].齐鲁药事,2011,30(5):285

[14]李辉,赵悦清,蒋妮谚,等.基于流通池装置的新溶出方法用于尼莫地平片的一致性评价[J].中国药科大学学报,2018,49(3):301

[18]张瑞卿,夏云,刘婧,等.醋酸亮丙瑞林原位注射制剂的制备及其体内外释放性能的研究[J].中国医院药学杂志,2019,39(7):691

孙悦,唐素芳,王卫,李娅男,张瑜.注射用醋酸亮丙瑞林缓释微球质量回顾与分析[J].药物分析杂志,2020,40(06):964-970.

基金:“十三五”国家重大新药创制专项(2017ZX09101001-007)资助.