杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是我国特有的木本药用植物[1,2],《神农本草经》将其列为上品[3],杜仲含有木脂素、苯丙素、黄酮、环烯醚萜、三萜等多种活性成分[4,5],具有降血脂、降血压[6]、降血糖[7]、抗骨质疏松[8]、抗肿瘤[9]、抗菌[10]、抗炎[11,12]等药理作用，传统上常以杜仲皮入药，但由于杜仲皮生长周期长，剥皮易造成原植物枯死，从而使得杜仲药用资源匮乏、价格昂贵，极大的限制了杜仲资源的可持续发展[13,14,15].研究表明，杜仲叶片的化学组成及药理作用和杜仲皮类似[16,17,18,19,20],并且前期课题组通过建立HFD诱导的高脂血症小鼠模型，证明杜仲叶和杜仲皮通过调节肠道菌群结构来改善高脂血症，二者在抗高脂血症作用方面无显著差异，杜仲叶可能是杜仲皮的合适替代品[21,22].目前关于杜仲叶的研究多集中在医药领域，包括对其活性成分提供工艺的优化、分离鉴定、药理作用以及质量标准等研究较多，但是生态环境对杜仲叶活性成分组成的影响被忽略，地理环境、气候类型和物种来源能够干扰植物次生代谢产物合成，是影响中药质量的重要因素[23].因此，有必要对不同区域的杜仲叶的化学组成和含量差异进行分析，从而为优化杜仲树种结构，促进杜仲资源高品质发展[24].

秦杜仲主要分布于陕西省略阳，该地区气候温和，降雨充沛，光照充足，土壤PH值(5.0～7.9)和土壤种类满足杜仲生长需求；而华杜仲是由国家林业局泡桐研究开发中心培育的新品种，适应性强，对土壤的酸碱度要求不严，抗干旱、寒冷的能力强，主要分布于河南省，本研究通过比较两种不同来源的杜仲叶中活性成分的差异，以期为不同地域杜仲树种的选育以及临床上应用标准提供理论依据.

1、材料与方法

1.1实验材料与仪器

1.1.1实验原料

秦杜仲采自于陕西省略阳县(北纬105.42′53″,东经33.23′6″),华杜仲来自于国家林业局泡桐研究开发中心，均自然晾干.将杜仲叶进行粉碎并过40目筛.

1.1.2实验试剂

芦丁对照品、金丝桃苷对照品、绿原酸对照品、没食子酸对照品、松脂醇二葡萄糖苷对照品，均HPLC≥98%,上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈，均色谱级，西安三浦精细化工厂；其余试剂均为国产分析纯.

1.1.3实验仪器及设备

Waters2998型高效液相色谱仪和紫外检测器，美国Waters公司；G1310A型高压泵，美国安捷伦科技有限公司；Varioskan fiash全波长扫描式多功能读数酶标仪，赛默飞世尔科技有限公司；FD-1D-50真空冷冻干燥机，无锡郎宁仪器制造有限公司；SHZ-DⅢ循环水式多用真空泵，江苏省金坛市金祥龙电子有限公司；RE52CS-1旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；HGZF-101-2电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司；H-1850R台式高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；HH-2电热恒温水浴锅，金坛市江南仪器场；WH-2微型涡旋混合仪，上海沪西分析仪器厂有限公司；Levo Pius Pipette移液枪，SCILOGEX.

1.2实验方法

1.2.1绿原酸标准曲线的制作

精密称定2 mg绿原酸标准品，加2 mL甲醇溶解，得到母液.按照梯度依次稀释为0.8 mg/mL、0.6 mg/mL、0.4 mg/mL、0.2 mg/mL、0.1 mg/mL、0.05 mg/mL,在波长为327 nm处测量其吸光值.以浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，制作相应标准曲线.

1.2.2单因素实验

秦仲叶和华仲叶的实验方案一致，分别称取适量叶细粉，按照实验条件调整对应料液比，相应体积分数的乙醇，在相应的温度下，提取相应的时间，提取两次，合并滤液，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，至贴壁，用20 mL50%甲醇水将提取物超声溶解至试管中.在327 nm波长下测定吸光度，利用标准曲线进行绿原酸浓度的计算，并计算得到含量.绿原酸提取率计算公式如下：

绿原酸提取率=C×V×Nm

式(1)中：C为通过标准曲线计算的绿原酸质量浓度，mg/mL; V为甲醇体积，mL; N为稀释倍数；m为样品质量，g.

(1)乙醇体积分数对绿原酸提取率的影响

准确称取2 g杜仲叶细粉，共5份，料液比例为1∶20 g/mL,用30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，60℃下提取50 min,共两次，合并提取液，离心后取上清，计算出绿原酸的提取率.

(2)提取温度对绿原酸提取率的影响

准确称取2 g杜仲叶细粉，共5份，料液比例为1∶20 g/mL,加入50%的乙醇，在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下提取50 min,共两次，合并提取液，离心后取上清，计算绿原酸的提取率.

(3)料液比对绿原酸提取率的影响

准确称取2 g杜仲叶细粉，共5份，料液比例分别为1∶15 g/mL、1∶20 g/mL、1∶25 g/mL、1∶30 g/mL、1∶35 g/mL,加入50%的乙醇，60℃下提取50 min,共两次，合并提取液，离心后取上清，计算绿原酸的提取率.

(4)提取时间对绿原酸提取率的影响

准确称取2 g杜仲叶细粉，共5份，料液比例为1∶20 g/mL,加入50%的乙醇，在60℃下分别提取30 min、40 min、50 min、60 min、70 min,共两次，合并提取液，离心后取上清，计算出绿原酸的提取率.

1.2.3响应面优化实验

基于单因素实验结果，采用Box-Behnken对绿原酸的最佳提取工艺进行了研究，并利用Design-Expert 8.0对其进行了试验设计和分析.选择体积分数、提取温度、提取时间等三个因子，将每个变量的低、中、高试验水平分别用A、B、C代替，得到的因素和水平设计见表1所示.

表1杜仲叶Box-Behnken试验因素水平及编码

1.2.4高效液相色谱法对杜仲叶中五种组分的同时检测

(1)供试品溶液的制备

秦仲叶供试品溶液：精密称取2 g秦仲叶细粉，料液比例为1∶20 g/mL,用50%乙醇在60℃下提取50 min,共两次，合并提取液，离心后取上清，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得.

华仲叶供试品溶液：精密称取2 g华仲叶细粉，料液比例为1∶20 g/mL,用50%乙醇在60℃下提取50 min,共两次，合并提取液，离心后取上清，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得.

(2)对照品溶液的制备

精密称定芦丁、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷、绿原酸及没食子酸对照品(质量分数≥98%)适量，加甲醇配制成0.8 mg/mL、0.4 mg/mL、0.2 mg/mL、0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.025 mg/mL的混合对照品溶液，用0.22μm的微孔滤膜过滤，即得.

(3)色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm);体积流量1 mL/min;柱温30℃;流动相乙腈(A)-0.4%磷酸水溶液(B),梯度洗脱(0 min, 95%B;40 min, 85%B;50 min, 75%B;60 min, 70%B;65 min, 95%B).其最大吸收波长均在260 nm左右，因此选择检测波长为260 nm,进样量20μL.

2、结果与讨论

2.1不同来源杜仲叶绿原酸含量差异分析

2.1.1绿原酸标准曲线构建

图1显示，在0.005～0.1 mg/mL的绿原酸标准品溶液中，吸收值线性关系较好.回归曲线方程为Y=20.57X+0.086 6,R2=0.999 5.经过稳定性实验、精密度实验等验证表明该标准曲线用于绿原酸质量浓度的计算有效，可靠.

图1绿原酸标准曲线 

2.1.2单因素实验考察不同因素对不同来源杜仲叶中绿原酸含量的影响

(1)乙醇体积分数对不同来源杜仲叶中绿原酸含量的影响

由图2可知，乙醇体积分数60%以上时绿原酸提取率最高可达50.56%,绿原酸是一种弱极性分子，溶液的极性差随浓度的增大而增大，会对绿原酸的浸出不利.此外，叶绿素等脂溶性成分的溶解速率随溶剂中酒精含量的提高而增加，提取液的绿色程度也逐渐加深.30%乙醇的浸出物为呈棕色，70%为墨绿色.在其他条件一定的情况下，60%乙醇提取效果最佳，因此选择50%、60%、70%三个水平作为考察因素.

图2乙醇体积分数对绿原酸提取率的影响 

(2)提取温度对不同来源杜仲叶中绿原酸含量的影响

由图3可知，随着温度的升高，绿原酸提取率先增加后逐渐降低.温度越高，分子的扩散速度越快，越有利于组分的溶解，绿原酸提取率在60℃时达59.49%.但是，温度越高，乙醇会汽化，杂质溶解也会增加，且绿原酸是一种热敏感的物质，容易被分解和破坏.在其他条件一定的情况下，60℃时绿原酸提取效果最佳，因此选择50℃、60℃、70℃三个水平作为考察因素.

图3提取温度对绿原酸提取率的影响 

(3)料液比对不同来源杜仲叶中绿原酸含量的影响

由图4可知，随着溶解剂量的增大，绿原酸提取率逐渐增大，尤其是1∶15增加到1∶20提高幅度较大，液料比超过1∶20时，提取率随之下降，变化缓慢.绿原酸提取率在1∶20时达64.57%,液料比增大，增加溶质和溶质的浓度差异，有利于物质的传质，但溶剂过多，不利于后续的旋蒸工序，且耗费成本.所以，选择1∶20为宜.

图4料液比对绿原酸提取率的影响  

(4)提取时间对不同来源杜仲叶中绿原酸含量的影响

由图5可知，随着时间的推移，绿原酸提取率逐渐提高.当细胞内、外浓度达到平衡时，其有效成分不会再被溶出，且时间过长，会造成绿原酸分解，降低提取率.50 min时，绿原酸提取率达49.10%.在其他条件一定的情况下，50 min时绿原酸提取效果最佳，因此选择40 min、50 min、60min三个水平作为考察因素.

图5提取时间对绿原酸提取率的影响 

2.1.3响应面法优化不同来源杜仲叶中绿原酸提取工艺

根据Design-Expert V8.0.6软件，输入响应面因素水平表，得出以下试验设计表(表2),以提取时间、提取温度、体积分数三个因素为自变量，以绿原酸提取率为响应值，得出绿原酸提取率Y(表2)、回归模型方差分析表(表3).

表2 Box-Behnken试验设计以及结果

使用设计Design Expert软件，对表2中的数据进行多元回归拟合，得出了绿原酸提取率(Y)的二次元多项回归方程，温度(A)、体积分数(B)、提取时间(C)真实值的回归模型方程为：

表3是显著性检验分析结果，二次多项模式在统计学上有很高的显著性(P<0.001),失拟项没有显著意义，其校正决定系数(R2adj为0.996 0,说明99.60%的绿原酸提取率变化可从该模型来说明.相关系数R2为0.998 2,表明绿原酸提取率与试验结果吻合良好，可应用于醇提物中的有效组分分析预测.回归公式中各个因子的系数值反映了各个指标对指标的影响，F值愈大，则说明其对指标的影响愈大，愈重要.从表3可知，影响杜仲叶中绿原酸提取的因素依次是：提取温度>提取时间>乙醇体积分数.

图6表示各因素的等高线图和曲面图，反映出了各因素之间的相互作用对结果的影响.响应面曲线为抛物线，表明该模型具有最大值.

由表4可得，该回归模型得到的提取绿原酸提取率最优工艺条件为提取温度64.56℃,体积分数59.91%、提取时间50.48 min.考虑到实际情况，将提取最佳参数设为：提取温度为65℃,60%乙醇、提取时间为50 min、以便进行验证试验.

图6影响杜仲叶绿原酸提取率的各因素之间相互作用的响应面及等高线图  

表4绿原酸最佳提取工艺

2.2 HPLC法测定不同来源杜仲叶中五种活性成分含量

2.2.1 HPLC方法学考察

(1)线性关系考察

精密吸取对照品溶液适量，甲醇逐级稀释成系列质量浓度，进样测定，记录峰面积.以对照品峰面积为纵坐标(Y),质量浓度为横坐标(X)进行回归，结果见表5所示.由表可知，各成分在各自范围内线性关系良好.

表5五种成分的线性关系

(2)精密度试验

精密吸取混合对照品，每次20μL,进样测定6次，测得芦丁、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷、绿原酸及没食子酸峰面积RSD分别为1.76%、1.93%、1.16%、2.88%和2.23%(n=6),表明该仪器的精密度良好.

(3)稳定性试验

精密称定杜仲叶粉2 g,配制供试品溶液，于室温下放置0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h时，进样测定，记录色谱峰图.测得芦丁、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷、绿原酸及没食子酸峰面积的RSD分别为1.65%、1.47%、2.89%、1.16%、2.90%(n=6),表明该样品的稳定性良好.

(4)重复性试验

精密称定杜仲叶粉2 g,平行6份，进样测定，记录色谱峰图.测得芦丁、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷、绿原酸及没食子酸含量RSD分别为1.15%、1.29%、2.87%、1.46%、2.13%(n=6),表明该方法重复性良好.

(5)加样回收率试验

精密称定杜仲叶粉2 g,平行6份，分别精密吸取混合对照品溶液(芦丁、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷、绿原酸及没食子酸质量浓度分别为0.656 mg/mL、0.488 mg/mL、0.589 mg/mL、0.553 mg/mL、0.021 mg/mL)各2 mL.制备样品6份，进样测定，计算回收率.结果，芦丁、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷、绿原酸及没食子酸平均加样回收率分别为98.91%、98.89%、98.20%、98.92%、98.82%,RSD分别为2.46%、3.14%、2.69%、2.78%、2.93%.

2.2.2杜仲叶中活性成分含量测定

取3份样品，制备供试品溶液，进样测定，记录对应待测组分的出峰面积，外标法计算各待测成分的含量，结果见表6所示，色谱图见图7所示.

表6各成分含量测定结果(n=3,mg/g)

图7 HPLC色谱图 

3、结论

单因素实验中，秦仲和华仲两者各因素影响程度主次顺序均为：提取温度>提取时间>乙醇体积分数>料液比.采用Design-Expert.V8.0.6软件，设计相应交互实验，建立最优提取条件为：温度65℃,醇含量60%,提取时间50 min,秦仲绿原酸理论提取率为63.93%,华仲绿原酸理论提取率为48.35%.在模型预测值的基础上，最优条件下重新提取5次，测得秦仲绿原酸提取率62.94%,华仲绿原酸提取率47.84%,与理论提取率吻合度分别为98%、97%,表明响应面优化的提取工艺可靠.并且秦仲和华仲二者由于所用部位和提取目标产物一致，绿原酸提取最优工艺条件较相近，文中单因素和响应面实验数据来源于华仲.

本研究建立的方法高效、简便、重现性好，可以较好地检测出杜仲叶五种成分的含量.杜仲叶绿原酸含量最高，秦仲中芦丁、松脂醇二葡萄糖苷含量比华仲高出1.97倍和6.59倍，但华仲金丝桃苷和绿原酸含量比秦仲高出1.41倍和1.16倍，两者没食子酸含量都较低，可能是由于陕西与山西两地气温和降水等关键地理因素所导致的.此结论与相关文献报道相符[25,26,27].本实验对两个产地的杜仲叶进行了活性成分含量测定，提示了秦仲和华仲的药用部位叶中的成分组成及含量存在明显的差异，为不同地域和不同用途树种的选择提供了理论支持，但是二者所含化学成分的差异是否对其药理作用、临床功效产生影响，还有待今后进一步探索.

参考文献:

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].2020年版.北京:中国医药科技出版社,2020.

[2]刘星.杜仲不同药用部位化学成分和含量的比较研究及在中成药中的应用[D].南京:南京中医药大学,2022.

[3]张留记,李宁,屠万倩,等.HPLC法同时测定杜仲叶中8种成分的含量[J].中国药房,2019,30(24):3 383-3 387.

[4]刘聪,郭非非,肖军平,等.杜仲不同部位化学成分及药理作用研究进展[J].中国中药杂志,2020,45(3):497-512.

[5]范彦博,周妍,刘大鹏,等.杜仲主要化学成分分类总结[J].中国药师,2014,17(10):1 756-1 760.

[8]王娟娟,秦雪梅,高晓霞,等.杜仲化学成分､药理活性和质量控制现状研究进展[J].中草药,2017,48(15):3 228-3 237.

[9]胡杨,李先芝,刘洋,等.杜仲化学成分､药理作用及应用研究进展[J].亚太传统医药,2022,18(2):234-239.

[10]郑杰,刘端,赵肃清,等.杜仲叶桃叶珊瑚苷的酶法提取及其抑菌活性[J].中药材,2012,35(2):304-306.

[12]肖芳,黄勤挽,范润勇,等.HPLC法同时测定杜仲3个药用部位中8种成分[J].中成药,2016,38(8):1 782-1 786.

[13]叶东旭,杜红岩,李钦,等.杜仲雄花HPLC指纹图谱及成分积累规律的研究[J].中成药,2012,34(4):706-709.

[14]赫锦锦.杜仲皮及雄化中次生代谢产物的变化规律研究[D].开封:河南大学,2010.

[15]曾桥,韦承伯,吕生华.杜仲叶主要活性成分研究进展[J].安徽农业科学,2017,45(34):133-135.

[16]项丽玲,温亚娟,苗明三.杜仲叶的化学､药理及临床应用分析[J].中医学报,2017,32(1):99-102.

[17]左月明,张忠立,王彦彦,等.杜仲叶环烯醚萜类化学成分研究[J].中药材,2014,37(2):252-254.

[18]张忠立,左月明,李于益,等.杜仲叶苯丙素类化学成分研究[J].中药材,2014,37(3):421-423.

[19]闫建昆,张翔宇,石旭柳,等.杜仲叶中黄酮类化学成分研究[J].中国现代中药,2021,23(4):599-604.

[20]龚频,韩业雯,翟鹏涛,等.杜仲叶的活性成分､药理作用及其在食品加工中的应用[J].食品工业科技,2022,43(10):395-404.

基金资助:陕西省科技厅重点产业创新链(群)-农业领域计划项目(2021ZDLNY04-01);陕西省教育厅服务地方科学研究计划项目(22JC021);陕西省秦创原“科学家+工程师”队伍建设项目(2022KXJ-16);

文章来源:龚频,柯瀛瀛,翟鹏涛,等.不同产地杜仲叶活性成分的定量分析[J].陕西科技大学学报,2024,42(04):70-77.